[发明专利]一种体外活化扩增人自然杀伤（NK）细胞的方法及其专用培养体系

权利要求书

1.用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，包括细胞激活剂和NK细胞扩增培养基，所述细胞激活剂包括：(1)抗人CD16单克隆抗体、(2)巨噬细胞激活脂肽-2(macrophage activating lipopeptide-2，MALP-2)和(3)溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的缓冲液；

所述NK细胞扩增培养基包括：1)基础培养基、2)无血清培养基添加剂、3)环氧化酶2(COX-2)抑制剂和4)细胞因子。

2.根据权利要求1所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：在细胞激活剂中，所述抗人CD16单克隆抗体的使用浓度为0.5-5mg/L(推荐浓度为1-2mg/L，优选浓度为1mg/L)；所述巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的使用浓度为1-100mg/L(推荐浓度为5-25mg/L，优选浓度为10mg/L)；所述溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-CL-NaCL溶液或其它不含EDTA或其它螯合剂的缓冲液，缓冲液的pH值为7.0-7.5(推荐pH值为7.1-7.3，优选pH值为7.2)。

3.根据权利要求1或2所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：所述细胞激活剂中的三种组分可分开存放(分别存放于不同的容器中)或混合存放。

4.根据权利要求1-3任一所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：在NK细胞扩增培养基中：

所述基础培养基选自RPMI1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或其中两种或三种基础培养基的组合(优选RPMI1640培养基)；

所述无血清培养基添加剂包括NaHCO₃、人白蛋白、人胰岛素、人转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂类混合物(例如亚油酸、亚麻酸、油酸、胆固醇的混合)、生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺、多胺混合物(例如腐胺、尸胺、亚精胺、精胺的混合)、氢化可的松琥珀酸钠、必需氨基酸(如赖氨酸、色氨酸等)和非必需氨基酸(如谷氨酸、丙氨酸等)中的多种或全部；其中白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂类混合物、必需氨基酸和非必需氨基酸为必需成分，生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺和多胺混合物为促进细胞增殖的添加物，氢化可的松琥珀酸钠为培养脐带血来源NK细胞是的专用添加剂；

所述环氧化酶2(COX-2)抑制剂为吲哚美辛(indomethacin)、NS-398和塞来昔布(celecoxib)中的一种(优选为吲哚美辛，吲哚美辛的浓度为0.5μM-50μM，推荐浓度为1-20μM，优选浓度为5μM)；

所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12和IL-18中的至少两种，优选使用IL-2和IL-15细胞因子组合，IL-2的浓度为2×10⁵-3×10⁶U/L(200U/mL-3000U/mL)，优选为1×10⁶U/L(1000U/mL)，IL-15的浓度为10-100mg/L(10-100ng/mL)，优选为50mg/L(50ng/mL)。

5.根据权利要求4所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：通用的NK细胞扩增培养基以RPMI1640培养基作为基础培养基，每升(/L)NK细胞扩增培养基含有：RPMI1640粉剂10.39g，NaHCO₃ 2g，人白蛋白0.5-5g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物1-10mL，乙醇胺1-10×10^-4M，脂类混合物1-10mL，生物素1-20mg，丙酮酸钠55-220mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸1-20mM，L-谷氨酰胺146-730mg，多胺混合物1-10mL，RPMI1640氨基酸溶液1-20mL，吲哚美辛0.5-10μM，IL-2 2×10⁵-3×10⁶U,IL-15 10-100mg。