[发明专利]一种用于微生物法定量检测叶酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种制备用于微生物法定量检测叶酸的微孔板的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)活化鼠李糖乳杆菌，将活化后的鼠李糖乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，35-39℃培养20-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；

2)加入9-11ml蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至9-11ml蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；

3)将所述测试菌液2-8μl添加至微孔板各孔中，分别在24-26mTorr、49-51mTorr、495-505mTorr、4-6Torr、49-51Torr、195-205Torr的低真空环境下加热测试菌液，使测试菌液在29-31℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24-48h，

其中，所述鼠李糖乳杆菌菌株为鼠李糖乳杆菌ATCC7469，并且步骤2)中蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为195-205mM、9-11mM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的活化鼠李糖乳杆菌采用活化方式为：

将10g脱脂奶粉加入90ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；

将0.2-0.3g粉末鼠李糖乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，36-38℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0-4℃保存；

将0.2-0.3ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，36-38℃培养直至凝乳；

重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。

3.一种由权利要求1或2所述的方法制备的微孔板。

4.一种包含权利要求3所述的微孔板的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包含叶酸标准品、叶酸测试培养基以及无菌水。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述叶酸测试培养基为10.0g/L活性碳处理的胰腺消化酪蛋白、40.0g/L葡萄糖、40.0g/L醋酸钠、1.0g/L磷酸二氢钾、1.0g/L磷酸氢二钾、0.6g/L L-天冬氨酸、0.5g/L L-盐酸半胱氨酸、0.2g/L无水硫酸镁、0.2g/L DL-色氨酸、0.1g/L聚山梨醇酯-80、20.0mg/L黄嘌呤、20mg/L氯化钠、20.0mg/L硫酸亚铁、15.0mg/L硫酸锰、10.0mg/L硫酸腺嘌呤、10.0mg/L盐酸鸟嘌呤、10.0mg/L尿嘧啶、5.0mg/L还原型谷胱甘肽、2.0mg/L对氨基苯甲酸、1.0mg/L核黄素、800μg/L泛酸钙、800μg/L烟酸、400μg/L盐酸硫胺素、20μg/L生物素。

7.一种制备权利要求4-6中任意一项所述的试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

先制备包被有鼠李糖乳杆菌菌株的微孔板：

1)活化鼠李糖乳杆菌，将活化后的鼠李糖乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，35-39℃培养20-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；

2)加入9-11ml蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至9-11ml蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；

3)将所述测试菌液2-8μl添加至微孔板各孔中，分别在24-26mTorr、49-51mTorr、495-505mTorr、4-6Torr、49-51Torr、195-205Torr的低真空环境下加热测试菌液，使测试菌液在29-31℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24-48h，从而制得定量检测叶酸用微孔板，

其中，所述鼠李糖乳杆菌菌株为鼠李糖乳杆菌ATCC7469，并且步骤2)中蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为195-205mM、9-11mM；

然后制备叶酸标准品及叶酸测试培养基。