[发明专利]一种用于微生物法定量检测叶酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法

说明书

本发明提供一种用于微生物法定量检测叶酸的微孔板，其由如下步骤制备而成：活化后的鼠李糖乳杆菌接种处理，然后加入海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液制成测试菌液；再将所述测试菌液添加至微孔板各孔中，在低真空环境下加热测试菌液，最后干燥处理。本发明还提供了包含该微孔板的试剂盒及其制备方法。本发明通过在制备中加入海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液保护剂，以及改进菌液的干燥方法，降低了试剂盒中的菌种损失，提高了叶酸检测结果的准确性。经活菌计数，上述方法制备的微孔板中的鼠李糖乳杆菌干燥泡沫中保存的活性菌种数，均超过了所添加菌液中菌种总数的93％(普通冷冻干燥法至少损失约20％的菌种)。

技术领域

本发明涉及一种用于微生物法定量检测叶酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法，属于微生物法检测领域。

背景技术

目前，国内外关于叶酸的检测方法都比较复杂，一般有微生物法、高效液相法和酶联免疫法。其中，高效液相法检测的下限较微生物法要高出很多，精度较好，但是需要昂贵的精密仪器和试剂，样品处理过程较为复杂，难以在生产上进行推广应用；另外，酶联免疫法检测结果与实际数值出入较大。而微生物法可灵敏地检测出具有生物活性的叶酸，这是微生物法区别于其他方法的最大特点及优势。

现有的微生物方法利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)对叶酸的特异性和灵敏性，定量测定出试样中叶酸的含量。在测定用培养基中供给除叶酸以外的所有营养成分，这样微生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中叶酸的含量相对应；以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中叶酸的含量。

但是包被有鼠李糖乳杆菌的试剂盒却存在诸多缺陷，现有方法在-80℃使微孔板中的微生物悬浮液冷冻休眠，然后将微孔板中的微生物团在真空下冷冻干燥。一些微生物为了适应不利环境，发生变异或重组，因此加入水或样品后，有些微生物在无维生素的条件下仍能生长，导致高检测背景，而且在个别情况下还会导致错误结果。另外，现有方法采用在真空下冷冻干燥，还可导致至少约20％的菌种损失。

因此，需要进一步改进微生物方法利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)对叶酸检测的方法。

发明内容

为了克服上述现有方法的不足，本发明提供一种用于微生物法定量检测叶酸的微孔板，可降低菌种损失，提高叶酸检测结果的准确性。

本发明的另一目的在于提供上述微孔板的制备方法。

本发明的还一目的在于提供包含该微孔板的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种用于微生物法定量检测叶酸的试剂盒的制备方法。

为了实现上述目的，本发明所述的一种用于微生物法定量检测叶酸的微孔板，其由如下步骤制备而成：

1)活化鼠李糖乳杆菌，将活化后的鼠李糖乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，35-39℃培养20-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；

2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；

3)将所述测试菌液2-8μl添加至微孔板各孔中，分别在24-26mTorr、49-51mTorr、495-505mTorr、4-6Torr、49-51Torr、195-205Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在29-31℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24-48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥24-48h。

其中，步骤1)中的活化鼠李糖乳杆菌采用活化方式：