[发明专利]一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用

说明书

本发明公开了一种编码rhFGF‑6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用，涉及生物医药领域。本发明提供的编码rhFGF‑6的核酸片段根据FGF‑6的天然序列优化而得，在天然序列的基础上去除了37个信号肽，消除了不利于表达的二级结构，但是不改变FGF‑6的氨基酸序列，将此核酸片段构建到合适的载体构成重组表达载体，再将重组表达载体转化进入宿主细胞，得到重组菌，培养该重组菌，用诱导剂进行诱导表达，能够高表达rhFGF‑6，并且表达的rhFGF‑6具有促进组织再生、促进骨生成、修复心肌损伤、促进创伤愈合、促进血管再生的活性。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种编码rhFGF-6的核酸片段、表达载体、宿主细胞、生产方法及应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子-6(Fibroblast Growth Factor-6，FGF-6)是FGF家族成员之一，属FGF4亚家族(FGF4、FGF5、FGF6)。人FGF-6基因定位于人类染色体12p13，共有约15kb的三个外显子，其编码的蛋白由208个氨基酸残基组成单链多肽，N端有约37个氨基酸残基的疏水信号肽序列，成熟蛋白有171个氨基酸(38-208氨基酸残基)，其理论分子质量为19kDa，等电点约为9.73。人FGF-6与鼠的氨基酸序列具有93.3％的高度同源性。哺乳动物FGF-6位点上的比较基因组学显示出人类、大鼠和小鼠FGF-6启动子是高度保守的。在结构上，FGF-6与FGF基因家族的其它成员是非常相似的，尤其与FGF-4(70％)、FGF-5(49％)具有高度的序列同源性。体内外的研究表明，FGF-6在分化发育、骨生成、肿瘤形成和其他细胞发育过程中也发挥着重要的作用。

先天性心脏病是指在胚胎发育时期由于心脏发育障碍而导致心脏形态、功能异常的疾病。Pax-8基因在调节心脏发育和心肌细胞凋亡的中有着重要作用，而Pax-8基因敲除小鼠的心脏中发现FGF-6的表达显著上调，表明FGF-6是Pax-8的下游基因而受到其调控。Lin S等将携带FGF-6基因的重组真核表达载体转染至大鼠H9C2心肌细胞中，使其得到有效过表达，测得心肌细胞的增殖能力变强，能抵抗由血清饥饿引起的细胞凋亡。(Zhang J,etal.Chinese Journal of Pathophysiology,2009,25(7):1292-1297；Gao Z,PLA MedicalJournal,2009,34(9):1082-1084；HuangX,ZhejiangX,Zhejiang.medicine,2010(11):1591-1593；L in S,et al.Journal of Wenzhou Medical College,2013,43(1):9-14.)

Grass等研究发现FGF-6和TGFβ-2可以协同刺激软骨结节的形成，诱导hMSC的定向分化与增殖，以应用到软骨组织修复中。Bosetti M等研究发现FGF-6可能是一个重要的调节骨生成和骨重构的因子，其在成骨细胞和破骨细胞中的活性证明了这一点，并推测FGF-6是通过RANKL激活MAP激酶的信号传导途径，随后激活破骨细胞，完成骨生成。(Hunziker EB,et al.OARS,2002,10(6):432-463；Dozin B,et al.MATRIX BIOL,2002,21(5):449-459；Jiang Y,Nature,2002,418(6893):41-49；Grass S,Development,1996,122(1):141-150；Bosetti M,J CELL PHYSIOL,2010,225(2):466-471.)

通常采用微生物发酵的方式生产rhFGF-6(recombinant human FGF-6，重组人FGF-6)，但是现有技术中微生物发酵表达rhFGF-6的表达量以及所表达的rhFGF-6的活性都很低，难以满足规模化应用的需求。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种编码rhFGF-6的核酸片段，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。该核酸片段消除了不利于表达的二级结构，并且不改变FGF-6的氨基酸序列。