[发明专利]一种电子束辐照联合酶法分离纯化高亲和钙的麦胚多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及功能肽的制备以及农产品精深加工的技术领域，尤其是涉及一种麦胚蛋白源钙螯合肽的方法。

背景技术

由于我国的饮食结构中植物性食品所占的比例较高，经常产生缺钙现象，尤其是儿童、孕妇以及老人，因此补钙成为国内学者研究中的重要课题。目前，市面上的补钙制剂主要为无机钙、有机钙、氨基酸钙。无机钙(如碳酸钙、磷酸钙、氯化钙等)，这类补钙剂在胃肠道中稳定性和溶解性差，吸收利用率低，对胃有刺激作用；有机钙(如乳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙等)，这类补钙剂钙含量低，总体利用率不高；氨基酸钙(如甘氨酸钙、谷氨酸钙等)，这类补钙剂钙吸收率显著提高，但易被植酸沉淀，有促进脂肪的氧化的不利影响；肽-钙，作为新一代的补钙产品有明显的优势，钙离子借助小肽的转运、吸收机制以螯合物的形式被小肠吸收，不仅加速钙的转运，而且耗能较少，显著促进钙的利用率。目前，关于肽-钙的研究主要集中于动物蛋白，对植物蛋白的研究较少，但是，动物蛋白成本高，存在潜在的过敏源，所以迫切需要开发植物源的蛋白用于肽-钙的制备。

小麦胚芽是面粉加工业的副产物(蕴藏量达到200～300万吨)，含有丰富的淀粉、蛋白质、不饱和脂肪、维生素以及矿物元素，被营养学家誉为“人类天然的营养宝库”，其中蛋白质含量占30％左右，是一种完全蛋白，必需氨基酸配比与WHO/FAO推荐的模式值基本接近，营养价值可与鸡蛋蛋白媲美。麦胚蛋白主要包括清蛋白、球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白。其中，球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的溶解性不好，在一定程度上限制了麦胚蛋白的综合利用，造成资源浪费、环境污染。为了节粮减损，增加麦胚的附加值，我们尝试采用电子束辐照处理结合酶法以及分离纯化的方法，制备高亲和钙的麦胚多肽。基于本发明制备的麦胚多肽-钙离子螯合物，不仅补充了钙元素和氨基酸，而且对小麦胚芽进行了精深加工有重要的经济和理论意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种电子束辐照联合酶法分离纯化高亲和钙的麦胚多肽的方法。本发明不仅能在较短时间内获得大量的活性肽，促进了麦胚蛋白的综合利用，而且，利用麦胚多肽制备的钙螯合肽能借助小肽的转运、吸收机制被小肠快速大量的吸收，显著提高了钙的利用率。

本发明的技术方案如下：

(一)一种电子束辐照联合酶法分离纯化高亲和钙的麦胚多肽，多肽的氨基酸序列为Phe-Val-Asp-Val-Thr。

(二)一种电子束辐照联合酶法分离纯化高亲和钙的麦胚多肽，包括以下步骤：

(1)以脱脂麦胚为原料，参考碱溶酸沉的方法提取麦胚分离蛋白，提取条件为：脱脂麦胚粉以料液比1:10分散于去离子水中，将分散液的pH调到pH为9.0～9.5，恒温40～45℃搅拌2h，离心获得上清液，将上清液pH调到pH为4.0～4.5来沉淀蛋白，将蛋白离心后调回pH为7.0，获得麦胚分离蛋白并冷冻干燥备用。

(2)麦胚分离蛋白干粉与去离子水按料液比10～40％(w/v)混合均匀，形成悬浊液，添加碱液调成弱碱性(pH为7.5～8.5)，将悬浊液密封于透明、耐辐照的密封袋中，悬浊液的厚度控制在1～2cm。

(3)利用电子束辐照技术对上述的蛋白悬浊液进行改性，改性条件为：辐照剂量为1～10kGy，辐照条件为1.5～5.0MeV/20～40mA。

(4)辐照过后的蛋白质经过碱性蛋白酶水解，得到麦胚蛋白酶解产物。水解条件为：蛋白浓度2～5％，酶解pH为8.0～8.5、温度50～60℃、酶与蛋白的重量配比为1:50～1:100。

(5)酶解产物首先利用超滤过程进行分离，截取<1kDa、1～3kDa、>3kDa的组分，分别收集各组分。

(6)收集超滤后的钙螯合率最高的组分，通过DEAE-FF 16/10阴离子交换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有0-0.5M NaCI的Tris-HCl，流速为5mL/min，洗脱峰在214nm下进行测量，透析脱盐。

(7)收集经过阴离子交换色谱分离得到的钙螯合率最高的组分，通过Superdex Peptide 10/300凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定。

(8)收集经过凝胶过滤色谱分离获得的钙螯合率最高的组分，通过RP-HPLC进行分离，分离条件是用5-30％乙睛溶液作为梯度洗脱液，流速lmL/min，洗脱液自含体积比为5％乙睛和95％水的混合液开始，至体积比为30％乙睛和70％水的混合液结束，进行梯度洗脱。