[发明专利]一种茶树快速转基因方法

权利要求书

1.一种茶树快速转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）茶树直播实生幼苗的准备；

（2）根癌农杆菌侵染液的制备；

（3）实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养；

（4）抗性芽的筛选与培养；

（5）再生抗性芽的分子生物学鉴定；

（6）转基因植株的扦插扩繁。

2. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（1）所述的茶树直播实生幼苗的准备方法为：选取成熟的健康饱满的茶树种子，用单蒸水清洗后直播于营养土中， 25℃温室中暗培养至4片真叶期。

3. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（2）所述的转化载体根癌农杆菌侵染液的制备方法为：将携带pCAMBIA1301载体的根癌农杆菌菌液接种至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的25mL YEB液体培养基中，28℃、200rpm/min黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，4000 rpm离心5min收集菌体，并重悬于无抗生素、含100μM乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl₂的25 mL MS液体培养基中，28℃振荡培养2 h后调OD₆₀₀ 至0.6-0.8用于侵染。

4.根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（3）所述的实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养的方法为：挑选生长良好的4片真叶期茶树幼苗，将其顶芽和腋芽去掉并保留真叶，用封口膜在其周围缠成漏斗状，用移液枪吸取OD₆₀₀为0.6-0.8的根癌农杆菌菌液打入漏斗至浸没切口，侵染40min后，弃盛有菌液的漏斗状封口膜，用封口膜封住切口保湿，在28℃下暗培养2天。

5. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（4）所述的抗性芽的筛选与培养方法为：暗培养2天后，将封口膜打开，用蘸有60 mg/L的潮霉素溶液的棉花擦拭切口处2次，并在切口处留有潮霉素溶液，再将封口膜包紧以筛选抗性芽，25℃下暗培养2-3周，当切口处长出抗性芽时转移到25℃下光照培养。

6. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（5）所述的再生抗性芽的分子生物学鉴定方法为：抗性芽长有2片叶以上时，取0.1g叶片，采用CTAB法提取基因组DNA；以pCAMBIA1301 载体GUS标记基因引物GUS-F/GUS-R进行PCR检测；同时以HYG标记基因引物HYG-F/ HYG-R进行进一步PCR的检测验证，以未转化的再生植株DNA为阴性对照，将扩增产物回收、TA克隆和测序验证；所用到的引物序列为：

GUS-F/GUS-R：扩增片段大小为375 bp，

GUS-F：ACGTCCTGAAGAAACCCCAACC，

GUS-R：TCCCGGCAATAACATACGGCGT；

HYG-F/GUS-R：扩增片断大小为675 bp，

HYG-F：CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG，

HYG-R：GAATCGGTCAATACACTACATGGC。

7. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（6）所述的转基因植株的扦插扩繁方法为：抗性芽长至9-11 cm有2/3木质化时即可剪取穂条，长度2.5-3.5 cm，带有一片成熟叶和一个饱满的腋芽，保证剪口平滑，稍有一定倾斜度，保持与母叶呈平行的斜面，为提高插穗的成活率，将剪口在62.5 g/L的生根粉溶液中浸泡1 min，然后斜插于被水浸润了的穴盘的营养土中，深度为插入插穗的2/3长度至叶柄与土层表面平齐，边插边将插穗附近的土稍压实，使插穗与土壤密接，以利于发根，插完立即浇水，使土壤保持湿润，25℃温室中遮光培养。