[发明专利]一种茶树快速转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种茶树快速转基因方法，属于转基因植物制备领域，主要应用于茶树种质资源创新。

背景技术

转基因是一种定向改造植物遗传性状和创造新变异的手段，目前，茶树转基因成功的报道较少，主要是采用农杆菌转化法和基因枪转化法。茶树因富含儿茶素等多酚类物质被认为是一种较难被农杆菌侵染的植物，转化频率较低。茶树中的多酚类物质一方面作为一种抑菌剂，直接杀死农杆菌而影响转化率；另一方面作为蛋白质的沉淀剂，拮抗Vir基因产物（一种结合在膜上的受体蛋白），阻塞发根农杆菌的T-DNA向茶树细胞运转的通道，从而间接影响茶树的遗传转化。

以农杆菌介导的茶树转基因所用的外植体主要为体细胞胚，但是茶树的离体再生难度较大，且体胚的诱导、成熟和萌发需要较长的时间，周期长，成本高，最终转基因成功的报道仅1例：Mondal等建立的转化体系通过嫁接转基因嫩梢获得了转基因植株，迄今为止国内外尚未有一套稳定完善的农杆菌介导的茶树遗传转化培养体系。不受基因型影响的基因枪技术在茶树遗传转化方面的工作起步迟，缺乏全面系统的研究，还有不少问题有待解决，如仪器的可控性、准确性、精确性以及基因枪轰击后进入受体细胞DNA的生物学变化及其调控机理等。研究发现农杆菌与基因枪结合使用可以进一步提高茶树遗传转化效率，但尚未得到茶树转基因植株。

发明内容

本发明针对目前茶树转基因研究的技术空白，提供了一种茶树快速转基因的方法，完全不依赖植物组织培养，对直播的实生茶树幼苗的去顶芽/侧芽/腋芽材料进行侵染，获得转基因植株；无需培育无菌试管苗，转基因抗性芽无需继代转接，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。本方法操作步骤简便、转基因效果显著、成本降低、试验周期短。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种茶树快速转基因方法，包括以下步骤：

（1）茶树直播实生幼苗的准备；

（2）根癌农杆菌侵染液的制备；

（3）实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养；

（4）抗性芽的筛选与培养；

（5）再生抗性芽的分子生物学鉴定；

（6）转基因植株的扦插扩繁。

其中，步骤（1）所述的茶树直播实生幼苗的准备方法为：选取成熟的健康饱满的茶树种子，用单蒸水清洗后直播于营养土中， 25℃温室中暗培养至4片真叶期。

步骤（2）所述的转化载体根癌农杆菌侵染液的制备方法为：将携带pCAMBIA1301载体的根癌农杆菌菌液接种至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的25mL YEB液体培养基中，28℃、200rpm/min黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，4000 rpm离心5min收集菌体，并重悬于无抗生素、含100μM乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl₂的25 mL MS液体培养基中，28℃振荡培养2 h后调OD₆₀₀ 至0.6-0.8用于侵染。

步骤（3）所述的实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养的方法为：挑选生长良好的4片真叶期茶树幼苗，将其顶芽和腋芽去掉并保留真叶，用封口膜在其周围缠成漏斗状，用移液枪吸取OD₆₀₀为0.6-0.8的根癌农杆菌菌液打入漏斗至浸没切口，侵染40min后，弃盛有菌液的漏斗状封口膜，用封口膜封住切口保湿，在28℃下暗培养2天。

步骤（4）所述的抗性芽的筛选与培养方法为：暗培养2天后，将封口膜打开，用蘸有60 mg/L的潮霉素溶液的棉花擦拭切口处2次，并在切口处留有潮霉素溶液，再将封口膜包紧以筛选抗性芽，25℃下暗培养2-3周，当切口处长出抗性芽时转移到25℃下光照培养。

步骤（5）所述的再生抗性芽的分子生物学鉴定方法为：抗性芽长有2片叶以上时，取0.1g叶片，采用CTAB法提取基因组DNA；以pCAMBIA1301 载体GUS标记基因引物GUS-F/GUS-R进行PCR检测；同时以HYG标记基因引物HYG-F/HYG-R进行进一步PCR的检测验证，以未转化的再生植株DNA为阴性对照，将扩增产物回收、TA克隆和测序验证；所用到的引物序列为：

GUS-F/GUS-R：扩增片段大小为375 bp，

GUS-F：ACGTCCTGAAGAAACCCCAACC，

GUS-R：TCCCGGCAATAACATACGGCGT；

HYG-F/GUS-R：扩增片断大小为675 bp，