[发明专利]新鲜间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，从脐带沃顿胶质中分离原代细胞，接种于培养皿，放置于培养箱中培养；

S2，差速贴壁，分离提纯脐带间充质干细胞；

S3，弃去培养皿中的第一培养基，换成新鲜的第一培养基；

S4，加入胰酶进行贴壁生长细胞传代；

S5，弃去培养皿中的第一培养基，换成新鲜的第一培养基；

S6，将S5处理后的细胞加入细胞冷冻保护液，置于-80℃温度下保存；

S7，将S6冷冻后的细胞进行复苏；

S8，将S7复苏后的细胞中加入第二培养基，洗脱细胞冷冻保护液，提取细胞悬液并进行培养；

S9，将S8培养后的细胞进行离心，弃去上清液，加入保养液中。

2.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S1步骤包括

S10步骤：从脐带中剥离沃顿胶质的步骤；

S11步骤：采用磷酸盐缓冲液对沃顿胶质进行清洗的步骤；

S12步骤：向离心管中加入S11处理后的沃顿胶质和胶原酶、放入摇床进行消化，获取原代细胞的步骤；

S13步骤：将S12获取的原代细胞进行离心、洗涤的步骤。

3.如权利要求2所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S12步骤中的消化温度为37℃，摇床速度为250 rpm，消化时间为2h。

4.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S2步骤包括

S20步骤，弃去培养皿中的培养基，加入PBS进行漂洗的步骤；

S21步骤，加入培养基，于培养箱中培养的步骤；

S22步骤，弃去培养皿中的培养基，加入PBS进行漂洗的步骤；

S23步骤，加入胰酶进行消化的步骤；

S24步骤，加入第一培养基终止消化的步骤；

S25步骤，接种于新培养皿，继续培养的步骤。

5.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第一培养基主要由氨基酸、维生素、无机盐和胎牛血清组成。

6.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第二培养基主要由氨基酸、维生素、无机盐组成。

7.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养箱为37℃5%的CO₂培养箱。

8.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S4步骤中传代时的消化时间为1-2min，贴壁时间为24-48h。

9.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S7步骤中复苏温度为37℃，复苏时间为2分钟。

10.如权利要求1所述的新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S9步骤中保养液为由生理盐水、白蛋白和谷氨酰胺组成的溶液，其中白蛋白和谷氨酰胺的质量分数分别为1%。