[发明专利]新鲜间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种新鲜间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：S1，从脐带沃顿胶质中分离原代细胞；S2，差速贴壁，分离提纯脐带间充质干细胞；S3，弃去培养皿中的第一培养基，换成新鲜的第一培养基；S4，加入胰酶进行贴壁生长细胞传代；S5，重复S3步骤；S6，将S5处理后的细胞加入细胞冷冻保护液，置于‑80℃温度下保存；S7，将S6冷冻后的细胞进行复苏；S8，将S7复苏后的细胞中加入第二培养基，洗脱细胞冷冻保护液，提取细胞悬液并进行培养；S9，将S8培养后的细胞进行离心，弃去上清液，加入保养液中；本发明新鲜间充质干细胞的制备方法，避免了冻存环节，制备出新鲜的间充质干细胞，使细胞活性和数量明显增多，不良反应更少，运输和使用更方便。

技术领域

本发明涉及干细胞制备技术领域，尤其涉及一种新鲜间充质干细胞的制备方法。

背景技术

当代细胞生物学研究表明，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）可以应用于多种疾病的治疗和康复，但是，在研究和应用中发现种子细胞存在种种问题，例如，胚胎干细胞的应用存在伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；自体骨髓单个核细胞存在成分复杂，具有多向分化潜能的干细胞含量低、分化潜能有限等问题；自体骨髓间充质干细胞来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降，体外长期扩增降低体内分化归巢潜能。

与自体间充质干细胞相比，脐血、脐带、胎盘间充质干细胞来源充足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，无社会、伦理和法律方面的争议，但脐带、胎盘分离细胞纯度低，常混有血管内皮细胞，临床不能应用。

另外，现有从脐带分离的MSC在使用前均冷冻保存在-196℃的液氮中，并需要加入冷冻剂DMSO（二甲基亚砜），使用时，再经过复温、解冻，解冻后的MSC存在如下不足：1）活性下降；2）回收率下降，大约15%的细胞死亡；3）冷冻剂有大量的副作用，如血压升高、心率改变，头痛等；4）运输不方便，需要液氮罐运输；5）输注不方便，需要解冻设备，如水浴箱等；6）容易造成污染。

发明内容

为了解决现有技术中间充质干细胞在使用前需冻存在-196℃极冷温度下的问题，本发明的目的是提供一种新鲜间充质干细胞的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，从脐带沃顿胶质中分离原代细胞，接种于培养皿，放置于培养箱中培养；

S2，差速贴壁，分离提纯脐带间充质干细胞；

S3，弃去培养皿中的第一培养基，换成新鲜的第一培养基；

S4，加入胰酶进行贴壁生长细胞传代；

S5，弃去培养皿中的第一培养基，换成新鲜的第一培养基；

S6，将S5处理后的细胞加入细胞冷冻保护液，置于-80℃温度下保存；

S7，将S6冷冻后的细胞进行复苏；

S8，将S7复苏后的细胞中加入第二培养基，洗脱细胞冷冻保护液，提取细胞悬液并进行培养；

S9，将S8培养后的细胞进行离心，弃去上清液，加入保养液中。

其中，所述S1步骤包括

S10步骤：从脐带中剥离沃顿胶质的步骤；

S11步骤：采用磷酸盐缓冲液对沃顿胶质进行清洗的步骤；

S12步骤：向离心管中加入S11处理后的沃顿胶质和胶原酶、放入摇床进行消化，获取原代细胞的步骤；

S13步骤：将S12获取的原代细胞进行离心、洗涤的步骤。