[发明专利]用于间充质干细胞（MSC）体外贴壁培养扩增的分子组合与应用

说明书

本发明公开了一种用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合与应用。该分子组合包括：凝血酶、孕酮、转化生长因子β1、抗坏血酸和氢化考的松或氢化考的松盐，将该分子组合物加入基于IMDM的基础培养基中得到体外贴壁扩增MSC培养基。用本发明的培养基体外贴壁培养扩增MSC避免了外源添加大量粘附分子，也避免了预铺板等复杂程序，其价格低廉，作用特异性高，很好地解决了MSC的贴壁增殖问题，适用于人骨髓和人脐带来源的间充质干细胞的培养，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物技术领域中的细胞培养方法，特别是涉及一种用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合与其在间充质干细胞(MSC)体外培养扩增中的应用。

背景技术

间充质干细胞，体外培养扩增后又称间充质基质细胞(mesenchymal stromalcells，MSC)，根据其来源又称骨髓基质细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞等。根据国际细胞治疗协会的定义，MSC是一群形态类似于成纤维细胞，表面表达干细胞标记CD90，间充质细胞标记CD73，不表达内皮细胞标记CD31，也不表达造血细胞标记CD34和CD45。此外，MSC具有成骨、成软骨和成脂肪的能力(Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,Slaper-Cortenbach I,Marini F,Krause D,Deans R,Keating A,Prockop Dj,Horwitz E.Minimal criteria fordefining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society forCellular Therapy position statement.Cytotherapy,2006；8(4):315-7)。

MSC具有体内外的免疫调节作用，也具有很强的促血管新生的功能。因此，自体或异体的MSC已经作为一种药物，被日本、新西兰、韩国和澳大利亚政府部门批准，用于治疗心肌梗塞、骨关节炎、移植物抗宿主病等疾病。细胞治疗需要一定的数量，而骨髓、脂肪、脐带等组织中的MSC含量很低，因此，需要体外培养扩增MSC才能达到治疗剂量。然而，通常人们使用胎牛血清扩增MSC，但是，胎牛血清的促细胞增殖活性具有明显的批次间差异，而且在培养过程中，MSC胞浆中可能残留牛血清中的蛋白，如牛血清白蛋白，由此可能会导致患者过敏反应，以及引起如疯牛病(BSE)、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)等疾病的风险(陈津，郭子宽，王立生，崔春萍，胡泽斌，吴朝晖，吴祖泽。大规模间充质干细胞培养技术评估报告。中国医药生物技术杂志2013；8(4)：274-84；王恒湘，郭子宽。间充质干细胞在组织再生应用中的诸多问题。组织工程与重建外科杂志2008；4(5)：241-5)。因此，使用无血清培养基培养MSC，是减少批次间差异以及临床应用安全性的可靠保证。

MSC是一种贴壁生长细胞，为维持细胞增殖活性，在无血清培养基中需添加大量的粘附分子，如黏连蛋白(fibronectin)、玻连蛋白、胶原等。或者，使用上述分子预铺板，之后接种单个核细胞或传代培养的MSC，以保障MSC的贴壁。加拿大StemCell公司(STEMCELLTECHNOLOGIES,Canada)提供的人MSC无血清培养基MesenCult^TM-ACF culture kit(货号为05449)就包含单独的细胞贴壁分子组合MesenCult^TM-ACF Attachment Substrate。在无血清培养基中添加粘附分子无疑会增加培养基成本，而单独提供粘附基质，会使细胞培养过程变得复杂。此外，由于选择不同生产厂或提供商的培养瓶/皿，MSC的粘附性也会发生变化，影响MSC的生长。因此，找到一种简单的促使MSC贴壁的体外培养扩增方法，具有一定的实用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合。