[发明专利]一种制备鲑鱼降钙素的方法

说明书

本发明公开了一种制备鲑鱼降钙素的方法。本发明提供的方法依次包括如下步骤：(1)将含有表达盒的重组载体导入受体植物，得到转基因植物；所述表达盒自上游至下游依次包括如下元件：植物油体蛋白基因的启动子、融合基因和终止序列；所述融合基因中含有编码蛋白标签的区段丙、编码植物油体蛋白的区段甲、蛋白酶的酶切识别序列和编码鲑鱼降钙素的前体的核酸分子；(2)取转基因植物的种子，提取油体；(3)利用所述蛋白标签从所述油体中纯化所述融合蛋白；(4)用蛋白酶酶切融合蛋白；(5)分离鲑鱼降钙素；(6)醋酸化；(7)脱盐。采用本发明所提供的方法可以得到生物学活性较高的鲑鱼降钙素。因此，本发明提供的方法具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备鲑鱼降钙素的方法。

背景技术

鲑鱼降钙素是由鲑鱼后腮体分泌的由32个氨基酸组成的单链多肽。鲑鱼降钙素作为治疗骨质疏松症等代谢性骨病的防治药已被载入多国药典，并已在多国行销近30年。鲑鱼降钙素具有调节体内钙、磷代谢及骨骼代谢的重要生物学功能，可降低血钙水平，还具有抗组胺、抗胆碱、抑制胃酸和胰腺分泌的作用。临床上主要用于治疗骨质疏松症。鲑鱼降钙素的生产方法主要有提取法、化学合成法和基因工程法。提取法是以鲑鱼、鳗鱼的鳃为原料，提取获得天然鲑鱼降钙素(生物学活性达到4500U/mg)，但由于原料有限，因此获得的天然鲑鱼降钙素极少。基因工程法是在大肠杆菌或酵母中表达鲑鱼降钙素，但由于鲑鱼降钙素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表达出的鲑鱼降钙素的生物学活性，仅为100-200U/mg。迄今为止，商业化销售的鲑鱼降钙素都是采用化学合成法生产的，化学合成法步骤多、得率低且价格昂贵，注射针剂中的鲑鱼降钙素为12000元/mg，原药价格也高达18000-20000元/g。如何制备生物学活性更高的鲑鱼降钙素是一个亟需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备鲑鱼降钙素。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备鲑鱼降钙素的方法。

本发明所提供的制备鲑鱼降钙素的方法，依次可包括如下步骤：

(1)将含有表达盒的重组载体导入受体植物，得到转基因植物；转基因植物中表达融合蛋白；所述表达盒自上游至下游依次包括如下元件：植物油体蛋白基因的启动子、融合基因和终止序列；

所述融合基因中可含有区段丙、区段甲、区段丁和区段乙；所述区段丙编码蛋白标签；所述区段甲编码植物油体蛋白；所述区段丁为蛋白酶的酶切识别序列；所述区段乙编码鲑鱼降钙素的前体；所述鲑鱼降钙素的前体为氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白质；

(2)取转基因植物的种子，提取油体；

(3)利用所述蛋白标签从所述油体中纯化所述融合蛋白；

(4)取步骤(3)得到的融合蛋白，用蛋白酶进行酶切；

(5)从步骤(4)的酶切产物中分离鲑鱼降钙素；

(6)醋酸化；

(7)脱盐。

所述融合基因中，5’末端为起始密码子，3’末端为终止密码子，中间为连续的编码区。

所述鲑鱼降钙素的前体在植物体内可自发形成鲑鱼降钙素。

所述融合基因自上游至下游依次可包括如下区段：所述区段丙、所述区段甲、所述区段丁和所述区段乙。

所述区段乙可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；