[发明专利]一种阳离子化香菇多糖的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性和核酸递送功能的阳离子化香菇多糖制备方法及其作为基因载体的同时发挥免疫学活性的应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康和生命的常见疾病之一，其发病率和死亡率呈上升趋势，国际癌症研究中心预测未来20年全球新增肿瘤病例会上升到每年2200万，肿瘤患者死亡病例将上升到每年1300万(IARC Science Public Lyon, 2014, 1: 1365)。肿瘤已成为全世界关注的极其重要的公共卫生疾病。目前，临床用于肿瘤治疗的大部分化疗药物，主要通过抑制细胞增殖和肿瘤生长发挥其作用，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞，其昂贵的医疗费用和较大的毒副作用严重影响了患者的生活质量，已经成为患者及学者所面临的共同难题，因而人们一直寻找最优化的肿瘤治疗方法。

中药在肿瘤治疗方面日益显现出很大的优势，已成为我国肿瘤治疗领域的一大特色。多糖是中药研究最深入、最广泛的抗肿瘤活性成分之一，更是中药抗肿瘤生理作用的主要物质之一，被称为“生物反应调节剂”。与直接杀伤肿瘤细胞的化疗药物不同，中药多糖除了具有直接抑制肿瘤细胞作用之外，更重要是通过其免疫调节作用刺激网状内皮系统，激活多种免疫细胞，提高宿主对肿瘤细胞的特异性抗原免疫反应能力，这也是防治肿瘤复发与转移的重要条件。赵国华等(药学学报, 2003, 38: 37)报道，山药多糖对Lewis 肺癌和B16黑色素瘤有最佳的抑制作用。李小定等(华中农业大学学报, 2002, 21: 261)实验证明，灰树花多糖既可直接杀伤癌细胞又可提高机体的免疫力。谢遵江等(解剖学报, 2002, 33: 538)发现人参多糖本身或诱导产生的细胞因子能增强IL-2对NK 细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的刺激作用，对肿瘤有极强的杀伤和抑制作用。中药抗肿瘤机制的研究为治疗肿瘤提供了理论基础，同时也开辟了新途径。

香菇多糖(Lentinan，LNT)是从传统药食同源的香菇中分离、提取得到的药用活性成分。1969年Chihara 等率先从香菇中提取出抗肿瘤活性的多糖，活性成分是它分支结构中的β-(1→3)-D-葡聚糖，它主链的葡萄糖基通过β-(1→3)糖苷键连接而成，侧链的葡萄糖基由分布的β-(1→6)糖苷键连接形成，分子结构中含有大量活性基团-OH。临床上，将香菇多糖与化疗药物联用可用于不能手术切除或转移复发性肿瘤的辅助治疗(Carbohydrate Polymers, 2012, 88: 966-972)。例如，其与紫杉醇联用可激活NLRP3炎性体和ASK1/p38MAPK信号通路诱导A549细胞凋亡(Critical Reviews In Food Science and nutrition, 2015, 10: 132)。香菇多糖/S-1联合治疗胃癌患者，结果原发灶明显缩小，且腹部CT未检测到淋巴结转移(Carbohydrate Polymers, 2016, 137: 52)。研究发现，香菇多糖本身对肿瘤细胞没有直接抑制作用，而是激活T细胞，促进淋巴细胞活化因子的产生，释放各种辅助性T细胞因子，增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率，最终达到杀伤肿瘤细胞的。

肿瘤的发生与发展都与基因直接或间接相关，从基因水平治疗肿瘤能够直接纠正和修复与肿瘤发病有关的基因，有效达到治疗肿瘤的目的。而基因治疗肿瘤的成功与否在很大程度上取决于安全、高效的基因传递载体。以多糖为骨架，经聚乙烯亚胺等改性得到的纳米载体不仅具有生物相容性好的优点，同时也能高效压缩核酸并转染至细胞(Advanced Drug Delivery Reviews, 2013, 65: 1123-1147)。因此，多糖类纳米载体已成为目前基因传递载体的研究热点之一(郑州大学学报, 2014, 4: 457-460)。香菇多糖分子结构中含有大量活性基团，通过对其进行阳离子化修饰可实现基因递送的功能，并且保留了香菇多糖的生物活性，但是至今未见到有关阳离子化香菇多糖作为基因传递载体的同时又发挥免疫调节作用的公开报道。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种阳离子化香菇多糖的制备方法，可作为基因载体递送系统并发挥免疫调节作用，有效解决肿瘤治疗中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，通过pH敏感型化学键将香菇多糖与低分子量的聚乙烯亚胺连接，香菇多糖分子量为20-800kD，聚乙烯亚胺分子量为600-1200D，聚乙烯亚胺与香菇多糖的摩尔比为1:3-10。具体制备方法是：