[发明专利]米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法

说明书

本发明公开了一种米根霉菌体全细胞催化制备L‑乳酸的方法，该方法中米根霉菌体培养18‑24小时后，过滤，回收菌体，将回收后的菌体置入催化反应器中，以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，直至反应至菌体培养液基本成固状且糖耗在5g/l以下结束，过滤，分离菌体和乳酸钙，回收的菌体继续在催化反应器中以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，如此循环，直到菌体催化效率明显降低为止。本发明利用米根霉菌体进行全细胞催化制备L‑乳酸，菌体在催化多次循环利用后，L‑乳酸的产量、生产强度、糖酸转化率均未有显著改变。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用米根霉菌体进行全细胞催化制备L-乳酸的方法，具体涉及一种利用高密度米根霉细胞，进行全细胞催化，高通量和快速合成L-乳酸的生产工艺。

背景技术

L-乳酸是一种重要的有机酸，在食品行业、材料行业有广泛的应用。其作为一种绿色化学品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等可降解材料，因而在材料领域备受关注。米根霉是微生物合成纯L-乳酸的主要菌株。目前，米根霉发酵生产L-乳酸最主要的问题是产量低(60-120g/l)，生产强度低(0.7-2.5g/l/h)，糖酸转化率低(90％以下)，从而导致米根霉很难应用于L-乳酸的生产。

传统米根霉生产L-乳酸的技术中，几乎都采用分阶段的策略，如将乳酸的生产分为菌体生长和酸生产阶段，并以此设计开发了相应的工艺，即：通过提供不同的培养基或者培养策略来适应该分阶段培养技术需求。比如，在菌体生长阶段，提供相应的培养基以供孢子的萌发以及菌体最初的需要，该培养基中富含菌体生长的营养，如蛋白胨、酵母膏、以及含氮的各种粉浆；在生长阶段结束以后，富含营养成分的培养基与具有转化能力的菌体被转运至用于生产的培养基中，经过新环境的生长适应期，菌体生长并进行乳酸的生产，直至发酵结束。其中，分阶段发酵策略最明显的特征即进行的移种操作，移种量通常为发酵液体积的5-15％，通常的生长适应期也从12-24小时不等。该发酵策略带来的技术问题在于，环境的改变会带来迟滞期，迟滞期通常认为是对发酵不利的，如延长发酵的周期，部分菌体由于对环境的改变而失去代谢或者催化能力。为了解决迟滞的问题，现有技术也采取了各种工艺调整，如增加移种的量，虽然可以解决部分问题，但是也带来不利的效果，比如移种量的加大会导致产量下降以及糖酸转化率的降低。

发明人而在后期的研究过程中，发现，米根霉菌体培养和产酸可以在同一个培养基中连续进行(可参见发明专利：连续法发酵生产L-乳酸的方法，公开号：CN104498542A)，在这种工艺条件下，米根霉发酵生产L-乳酸的菌体量增加了，同时减少了发酵阶段的延滞期，从而使L-乳酸生产强度和产量得到了极大地提高。然而，该方法虽然能极大地提高乳酸产量和生产强度，但在进行多批次操作过程中，还存在缺陷，不利于菌体多批次循环使用。在一步连续发酵的基础上，还需进一步高效利用米根霉菌体，实现米根霉细胞多批次循环使用。

发明内容

传统的连续发酵的工艺是孢子液接入到培养液中，前期进行米根霉菌体的培养，当培养至18-24h时(此时开始有乳酸生成)，减少发酵液体体积至原体积的50％-70％，菌体量保持不变，即增加菌体密度，继续进行产酸。该工艺经验证能极大地提高乳酸的生产强度，缩短发酵时间，同时，采用连续补料发酵，乳酸的产量也得到了极大的提高，但是该工艺存在如下弊端还有待改进：连续培养过程中，发酵结束后，发酵液较为粘稠，多以乳酸钙为主，在无菌操作条件下，菌体与发酵液分离较为困难，菌体较难回收，不利于后期菌体的二次利用，造成菌体的利用率下降，增加生产成本，存在弊端，不利于工业化生产；在乳酸发酵过程中，氮源量较少(培养开始时，添加2-3g/l蛋白胨，蛋白胨基本上用于菌体生长)，因此，发酵体系中，氮源主要用于米根霉生长，而发酵期，氮源量较少，菌体生成量较低。氮源主要用于维持细胞代谢，基于此，本发明改进一步发酵工艺，提出全细胞催化制备乳酸。

本发明的目的是克服上述不足之处提供一种高效利用米根霉菌体，实现米根霉细胞多批次循环使用的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法。