[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1) 筛选猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性的动物作为实验动物，对每只实验动物进行免疫接种：

用猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫：对每只实验动物皮下或肌肉注射0.5-2mL猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫；

用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫：基础免疫7--10天后对每只实验动物进行皮下或肌肉注射猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫接种，每次免疫接种的时间间隔为7-10天，第1次接种量为1-3头份，以后每次接种量比上一次增加2-3头份或者做倍增接种；

2）最后一次免疫后28-42天，无菌采集实验动物血清，以细胞中和抗体效价检测法检测，确认血清抗体为阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即收获猪流行性腹泻病毒阳性血清。

2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述中和抗体效价的测定方法如下：

S1： 将采集的实验动物血清在56℃下灭活30min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪流行性腹泻病毒抗原于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；

S2：用细胞板培养VERO细胞，当VERO细胞生长24小时以上，细胞密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；

S3：将细胞板置于37℃的CO₂培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价。

3.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述实验动物为豚鼠或兔。

4.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。

5.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤2) 无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离血清。

6.根据权利要求2的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的维持液为DMEM维持液。

7.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的猪流行性腹泻病毒抗原的浓度为200TCID₅₀/0.1mL。

8.根据权利要求21述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:256以上。

9.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1每个稀释度的血清与猪流行性腹泻病毒抗原等量混合。

10.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述细胞板为96孔细胞板。