[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用医药生物技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法。

背景技术

流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea ofSwine，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪接触性肠道传染病。以呕吐、腹泻和脱水为特征，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率高。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15-90%。病猪是主要传染源。发病猪症状的轻重随年龄的大小而有差异，年龄越小，症状越重。一周龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50%，最高的死亡率达100%。断奶猪、母猪常呈精神萎顿、厌食和持续性腹泻大约一周，并逐渐恢复正常。少数猪恢复后生长发育不良。肥育猪在同圈饲养感染后都发生腹泻，一周后康复，死亡率1--3%。成年猪症状较轻，有的仅表现呕吐，重者水样腹泻3-4天可自愈。而猪流行性腹泻病毒阳性血清是目前主要应用于鉴别、检验、诊断的蛋白类物质，此免疫球蛋白（抗体）是一种能攻击异己物质（抗原）并促进嗜中性粒细胞和巨噬细胞吞噬免疫球蛋白-抗原复合物的蛋白质，因此它们在清除细菌和病毒中起着重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用兔或豚鼠制备猪流行性腹泻病毒阳性血清的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：

1) 筛选猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性的动物作为实验动物，对每只实验动物进行免疫接种：

用猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫：对每只实验动物皮下或肌肉注射0.5-2mL猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫；

用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫：基础免疫7--10天后对每只实验动物进行皮下或肌肉注射猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫接种，每次免疫接种的时间间隔为7-10天，第1次接种量为1-3头份，以后每次接种量比上一次增加2-3头份或者做倍增接种；

2）最后一次免疫后28-42天，无菌采集实验动物血清，以细胞中和抗体效价检测法检测，确认血清抗体为阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即收获猪流行性腹泻病毒阳性血清。收集的猪流行性腹泻病毒阳性血清经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的免疫动物血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染的阳性血清冻存备用。

所述实验动物为小鼠、豚鼠或兔。作为实验用的动物，首先采集其血清检测，验证其均不具有猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪Ⅱ型圆环病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒等的抗原、抗体。

所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。

所述步骤2) 无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离血清。

本发明所述中和抗体效价的测定方法如下：

S1： 将采集的实验动物血清在56℃下灭活30min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪流行性腹泻病毒抗原于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；

S2：用细胞板培养VERO细胞，当VERO细胞生长24小时以上，细胞密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；

S3：将细胞板置于37℃的CO₂培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价。

所述步骤S1的维持液为DMEM维持液。

所述步骤S1的猪流行性腹泻病毒抗原的浓度为200TCID₅₀/0.1mL。

所述步骤S1的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:256以上。

所述步骤S1每个稀释度的血清与猪流行性腹泻病毒抗原等量混合。

所述细胞板为96孔细胞板。