[发明专利]一种农药对蜜蜂幼虫的毒性评价方法

权利要求书

1.一种农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，其特征在于：步骤为：

(1)试验生物为1日龄的蜜蜂幼虫，3～6日龄开始暴露染毒；以系列浓度组进行预备试验；根据预备试验确定的浓度范围，正试验设置不少于5个覆盖EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的浓度组，同时设空白对照组，当使用溶剂时，增加设置溶剂对照组；

(2)正试验结果观察：于第4d～8d及第15d观察并记录幼虫死亡数、其它异常情况，身体僵硬不动或轻微触碰无反应或第15d未化蛹的幼虫则判定为死亡，同时将死亡的幼虫去除，第22d观察并记录蛹死亡数、羽化数及观察到的异常情况；

(3)药剂对蜜蜂幼虫EC₅₀/ED₅₀或者NOEC/NOED值的测定：蜜蜂幼虫毒性试验以羽化率为主要评价指标，统计蜜蜂发育的幼虫死亡率、蛹死亡率、羽化率，进行统计学分析计算EC₅₀/ED₅₀及置信限；采用方差分析对各个浓度处理组与对照组间进行差异显著性分析，获得供试物对蜜蜂羽化影响的NOEC/NOED。

2.如权利要求1所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，其特征在于：蜜蜂幼虫获得的方法为：

(1)首先，将蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王产卵器中，禁闭24h，待其产卵后释放蜂王，产卵75h后用移虫针将1日龄的幼虫随机转移至温度34℃～35℃的育王台基中，每个台基放入1只幼虫，然后将移入了幼虫的王台基置于24或48孔细胞培养板；每个培养板含有来自3个种群的幼虫；幼虫在试验条件下，用人工饲料饲养；

(2)在化蛹培养板中放入纸巾，将纸巾贴合孔的底部和边缘，将蛹培养板和盖子进行紫外灭菌15分钟；当D6～D8蜜蜂幼虫消耗完所有食物时，就将幼虫从培养板转移到化蛹培养板中；

(3)在幼虫或预蛹转至化蛹板之前，保持相对湿度95％±5％；预蛹转至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前，保持相对湿度80％±5％，化蛹板放入孵化盒之后至试验结束，保持相对湿度50％～80％；试验期间将干燥器放置于蜜蜂幼虫孵化器中，使干燥器温度均匀保持在34℃～35℃，黑暗的条件下进行；蜜蜂幼虫达到3日龄开始试验。

3.如权利要求2所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，其特征在于：幼虫人工饲料的成分包括但不限于蜂皇浆、酵母提取物、果糖、葡萄糖；蜜蜂幼虫使用的三种饲料的成分及重量份为：

饲料A为：酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆＝0.9:5.3:5.3:44.25:44.25；

饲料B为：酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆＝1.3:6.4:6.4:42.95:42.95；

饲料C：酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆＝2:9:9:30:50；1日龄饲喂20μL饲料A，2日龄不进行饲喂，3日龄饲喂20μL饲料B、4日龄饲喂30μL饲料C、5日龄饲喂40μL饲料C、6日龄饲喂50μL饲料C。

4.如权利要求3所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，其特征在于：饲料配置时需先将果糖、葡萄糖和酵母提取物完全溶解于无菌水后再与新鲜王浆混匀；混匀食物采用采用手动搅拌和涡旋振荡的方法；饲料新鲜配制并保存在0～5℃的冰箱里；或提前制备，冷冻保存直至使用。

5.如权利要求2所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，其特征在于：步骤(2)中的纸巾为：1m×2cm的纸巾。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)移虫前将培养板、移虫针、人工育王台基浸没在70％酒精至少30min进行杀菌后，晾干待用；往每个培养板移虫时间≤20分钟；使用移液器向每个王台基内供应食物。

7.如权利要求1所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，其特征在于：所述的暴露染毒的步骤为：每天用混有供试物的饲料饲喂蜜蜂幼虫，3日龄饲喂20μL饲料B、4日龄饲喂30μL饲料C、5日龄饲喂40μL饲料C、6日龄饲喂50μL饲料C；使用水溶解的供试物，投喂的含毒饲料中受试溶液的量为≤10％；或使用有机溶剂溶解，投喂的含毒饲料中受试溶液的量≤2％。

8.如权利要求1所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，其特征在于：预备试验使用细胞培养板，设置空白与溶剂对照组：每个浓度3个重复，每个重复12头幼虫。