[发明专利]一种农药对蜜蜂幼虫的毒性评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及农药风险评价方法，具体涉及一种农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法。

背景技术

蜜蜂是农业生产中主要的授粉物种。蜜蜂授粉可减少农药化肥的施用，适宜生态农业和绿色农业的发展；对维护农业生物多样性、稳定性具有重要生态功能。有研究显示：全球约87.5％的开花植物依靠昆虫授粉，其中87种为主要粮食作物，占世界粮食总产量的35％，而蜜蜂约占授粉昆虫总数的80％，无论是人工饲养还是野生存在，都在作物授粉方面发挥着巨大作用。同时蜜蜂授粉所产生的经济效益也相当可观，每年仅我国由蜜蜂传花授粉带来的经济效益就高达150亿元。因此，蜜蜂具有重大的生态和经济价值。但蜜蜂对农药敏感程度极高，滥用或误用农药都将破坏蜜蜂栖息地及其食物来源，从而对蜜蜂产生严重威胁。1990年至今，因农药中毒导致蜜蜂死亡、蜂群数量骤减的现象遍及北美、欧洲、亚洲等许多国家，已成为全球普遍关注的环境污染与生物安全问题。

为保护生态系统健康，从源头控制高风险性农药对环境生物产生的潜在不良影响，我国环保部、农业部也逐渐将农药对蜜蜂生物毒性与安全性评价列为农药登记管理、农药使用环境安全管理的重要内容之一，并制定了农药对蜜蜂急性毒性试验准则。但迄今为止，我国作为农药生产和使用第一大国，并未建立完整的农药对蜜蜂安全性风险评价体系。总体来看：我国农药对蜜蜂生物安全性风险评价工作比较落后，表现在实验方法上缺乏亚慢性、慢性试验方法，评价体系缺乏立体多层次实验。

发明内容

本发明公开了一种农药对蜜蜂幼虫毒性试验的方法和药剂对蜜蜂幼虫NOEC/NOED值的毒性测定方法，完善了农药对蜜蜂慢性毒性试验评价体系。

本发明的实验方案为：

一种农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，步骤为：

(1)试验生物为1日龄的蜜蜂幼虫，3～6日龄开始暴露染毒；以系列浓度组进行预备试验；根据预备试验确定的浓度范围，正试验设置不少于5个覆盖EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的浓度组，同时设空白对照组，当使用溶剂时，增加设置溶剂对照组；

(2)正试验结果观察；于第4d～8d及第15d观察并记录幼虫死亡数、其它异常情况，身体僵硬不动或轻微触碰无反应或第15d未化蛹的幼虫则判定为死亡，同时将死亡的幼虫去除，第22d观察并记录蛹死亡数、羽化数及观察到的异常情况；

(3)药剂对蜜蜂幼虫EC₅₀/ED₅₀或者NOEC/NOED值的测定；蜜蜂幼虫毒性试验以羽化率为主要评价指标，统计蜜蜂发育的幼虫死亡率、蛹死亡率、羽化率，进行统计学分析计算EC₅₀/ED₅₀及置信限；采用方差分析对各个浓度处理组与对照组间进行差异显著性分析，获得供试物对蜜蜂羽化影响的NOEC/NOED。

不同时间观察并记录蜜蜂不同虫态的死亡数、化蛹、羽化成蜂情况。计算幼虫死亡率、蛹死亡率、羽化率，半效应浓度/半效应剂量(EC₅₀/ED₅₀)；将供试物处理组和空白对照组的羽化率进行差异显著性分析，确定无可见效应浓度/无可见效应剂量(NOEC/NOED)。不可见效应浓度(NOEC)值用通过方差分析得出：若与空白试验组没有显著性差异的最高浓度，即为NOEC值；或通过浓度-效应关系得出：与空白实验组相比，根据实验测试所得的浓度-效应关系，其影响程度低于空白的10％的浓度，即视为NOEC值。

所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，蜜蜂幼虫获得的方法为：

(1)首先，将蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王产卵器中，禁闭24h，待其产卵后释放蜂王，产卵75h后用移虫针将1日龄的幼虫随机转移至温度34℃～35℃的育王台基中，每个台基放入1只幼虫，然后将移入了幼虫的王台基置于24或48孔细胞培养板；每个培养板含有来自3个种群的幼虫；幼虫在试验条件下，用人工饲料饲养；

(2)在化蛹培养板中放入纸巾；将巾贴合孔的底部和边缘，将蛹培养板和盖子进行紫外灭菌15分钟；当D6～D8蜜蜂幼虫消耗完所有食物时，就将幼虫从培养板转移到化蛹培养板中；

(3)在幼虫或预蛹转至化蛹板之前，保持相对湿度95％±5％；预蛹转至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前，保持相对湿度80％±5％，化蛹板放入孵化盒之后至试验结束，保持相对湿度50％～80％；试验期间将干燥器放置于蜜蜂幼虫孵化器中，使干燥器温度均匀保持在34℃～35℃，黑暗的条件下进行；蜜蜂幼虫达到3日龄开始试验。