[发明专利]一种莱茵衣藻叶绿体的提取方法

权利要求书

1.一种莱茵衣藻叶绿体的提取方法，包括如下步骤：

(1)取一定量新鲜的莱茵衣藻细胞，通过温和机械破碎获得包含有完整叶绿体的细胞碎片浓缩液；

(2)通过密度梯度离心，收集叶绿体。

2.根据权利要求1所述的莱茵衣藻叶绿体的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中莱茵衣藻细胞的叶绿体在光学或电子显微镜下需保持完整，尤其是营养盐胁迫条件下包括无氮或无磷的藻细胞叶绿体膜结构应保持完整性；

所述莱茵衣藻既可以是在Minimal培养基的富营养条件下培养所获得的生物质，也可以是在无氮或无磷Minimal培养基的营养胁迫条件下所获得的生物质。

3.根据权利要求1或2所述的莱茵衣藻叶绿体的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的藻细胞破碎操作为：将含6～10mg叶绿素的藻细胞用30～50mM Hepes-KOH pH 7.5～8.0离心清洗1～2次，离心条件为2000～3000g、5～10min、4～10℃，弃上清；

用30～50mM Hepes-KOH pH 7.5～8.0重悬细胞，再次如上述条件离心，重复操作1～2次，获得的藻细胞浓缩液可以通过Yeda press、Bioneb、French press或具有等效破碎效果的不锈钢针头破碎器借助机械剪切力来破碎，其中作用于藻细胞浓缩液的惰性气氛气体(如氮气和/或氦气)的破碎压力为0.35～0.75MPa。

4.根据权利要求1所述的莱茵衣藻叶绿体的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)的操作为：将步骤(1)中10～15ml含0.3～0.5mg ml^-1叶绿素的细胞破碎液在750～5000g及4～10℃下离心2～5min后，加入2～5ml叶绿体分离缓冲液，混合均匀后转至由Percoll、Ficoll或蔗糖制备的密度梯度液中，此密度梯度液等效于含有体积百分比分别为20～25％、45～50％、65～70％的Percoll密度梯度液(它们的体积比例为1～2∶1～3∶1～2)，在4200～5000g及4～10℃下离心15～30min；将等效于45～65％Percoll梯度液之间的叶绿体条带加入相当于其10～15倍体积的叶绿体分离缓冲液进行稀释，混合均匀后在670～5000g及4～10℃下离心1～5min，弃上清后加入相当于底部浓缩物1～5倍体积的叶绿体保存液进行稀释，叶绿体保存液组成为30～50mM HEPES–KOH pH 8.0及终浓度0.3～0.5M山梨醇，混合均匀后即为叶绿体提取液。