[发明专利]一种莱茵衣藻叶绿体的提取方法

说明书

本发明公开了一种莱茵衣藻叶绿体的提取方法，通过将压差机械破碎、密度梯度离心与脂肪酸丰度分析方法结合，能够有效的提取纯度和完整度高的叶绿体，以叶绿素计，叶绿体提取产率为0.5～30％。本方法尤其适用于常规方法难以提取的胁迫培养条件下的莱茵衣藻叶绿体提取，为微藻亚细胞水平研究提供有效的生物材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微藻细胞器分离纯化技术领域，具体涉及一种莱茵衣藻叶绿体的提取方法。

背景技术

作为光合作用中心，叶绿体是植物及微藻中氨基酸、脂肪酸及叶绿素的合成场所，参与多种生理代谢过程，因此叶绿体的获得能为亚细胞水平的各种生物化学研究提供有效的生物材料。模式生物莱茵衣藻只含有一个杯状叶绿体，已有研究学者自莱茵衣藻中分离出了富营养生长条件下的叶绿体，这些叶绿体大多是在特定生长条件及分离条件下获得的，具有一定局限性，此外提取出的叶绿体质量评价方法都是基于传统的鉴定方法，如通过酶的特异性亚细胞定位来确定叶绿体的纯度、通过铁氰化钾放氧测试法来确定叶绿体被膜的完整度或通过电子显微镜直接观察法来确定叶绿体的纯度及完整度，这些方法不但需要依赖于离体叶绿体的生理活性，不利于实现叶绿体的重复提取，而且耗时耗力，尤其是电子显微镜样品的制备与观察，不能及时地确定获得叶绿体的质量状态，从而使得叶绿体的优化提取研究停滞不前。此外，微藻叶绿体在胁迫条件下能积累淀粉粒或油滴，这些代谢产物的形成能使叶绿体的膜结构发生扭曲，常规提取方法已不再适用于胁迫叶绿体的提取。本发明扩大了微藻叶绿体提取的适用范围，建立了一种温和破碎细胞及高效快速的质量评价方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种莱茵衣藻叶绿体的提取方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案内容为：

(1)取一定量新鲜的莱茵衣藻细胞，通过温和机械破碎获得包含有完整叶绿体的细胞碎片浓缩液；

(2)通过密度梯度离心，收集叶绿体。

所述步骤(1)中莱茵衣藻细胞的叶绿体在光学或电子显微镜下需保持完整，尤其是营养盐胁迫条件下包括无氮或无磷的藻细胞叶绿体膜结构应保持完整性；

所述莱茵衣藻既可以是在Minimal培养基的富营养条件下培养所获得的生物质，也可以是在无氮或无磷Minimal培养基的营养胁迫条件下所获得的生物质。

所述步骤(1)中的藻细胞破碎操作为：将含6～10mg叶绿素的藻细胞用30～50mMHepes-KOH pH 7.5～8.0离心清洗1～2次，离心条件为2000～3000g、5～10min、4～10℃，弃上清；

用30～50mM Hepes-KOH pH 7.5～8.0重悬细胞，再次如上述条件离心，重复操作1～2次，获得的藻细胞浓缩液可以通过Yeda press、Bioneb、French press或具有等效破碎效果的不锈钢针头破碎器借助机械剪切力来破碎，其中作用于藻细胞浓缩液的惰性气氛气体(如氮气和/或氦气)的破碎压力为0.35～0.75MPa。

所述步骤(2)的操作为：将步骤(1)中10～15ml含0.3～0.5mg ml^-1叶绿素的细胞破碎液在750～5000g及4～10℃下离心2～5min后，加入2～5ml叶绿体分离缓冲液，混合均匀后转至含有体积百分比分别为20～25％、45～50％、65～70％的Percoll密度梯度液中(它们的体积比例为1～2∶1～3∶1～2))，在4200～5000g及4～10℃下离心15～30min；将45～65％Percoll梯度液之间的叶绿体条带加入相当于其10～15倍体积的叶绿体分离缓冲液进行稀释，混合均匀后在670～5000g及4～10℃下离心1～5min，弃上清后加入相当于底部浓缩物1～5倍体积的叶绿体保存液进行稀释，叶绿体保存液组成为30～50mM HEPES–KOH pH8.0及终浓度0.3～0.5M山梨醇，混合均匀后即为叶绿体提取液。