[发明专利]一种检测融合基因BCR‑ABL(P210）mRNA表达的试剂盒

权利要求书

1.一种Real-Time Q-PCR检测融合基因BCR-ABL(P210) mRNA表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：（1）RNA提取试剂、BCR-ABL(P210)反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、BCR-ABL(P210)阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和阴性对照品，和（2）分隔并集中包装这些试剂管的包装盒；

其中，所述BCR-ABL(P210)反应液中正向和反向引物分别是：

5’-TCCACAGCATTCCGCTGAC-3’（SEQ ID NO:1），

5’- CACTCAGACCCTGAGGCTCAAA-3’（SEQ ID NO:2）；

所述BCR-ABL(P210)反应液中寡核苷酸探针是：5’-X-GCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-Y-3’ （SEQ ID NO:3），其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；

所述ABL反应液中正向和反向引物分别是：

5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’（SEQ ID NO:4），

5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’（SEQ ID NO:5）

所述ABL反应液中寡核苷酸探针是：

5’-X- ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA -Y-3’ （SEQ ID NO:6），其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；

所述BCR-ABL(P210)阳性定量参考品1-5均为含有BCR-ABL(P210)目的片段的重组质粒，其浓度为1×10³拷贝/5μL～1×10⁷拷贝/5μL；

所述ABL阳性定量参考品1-4均为含有ABL目的片段的重组质粒，其浓度为1×10³拷贝/5μl～1×10⁶拷贝/5μl。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述BCR-ABL(P210)反应液和ABL反应液均包含PCR缓冲液，所述的PCR缓冲液包含10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl和3.0mmol/L MgCl₂。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法PCR酶系包含逆转录酶（c-MMLV酶）、热启动Taq酶、RNasind、NTPs和酶稀释液组成。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述BCR-ABL(P210）阳性定量参考品1-5均为含有BCR-ABL(P210）目的片段的重组质粒，浓度为10⁷copies/5ul~10³copies/5ul；ABL阳性定量参考品1-4均为含有ABL目的片段的重组质粒，浓度为10⁶copies/5ul~10³copies/5ul；质粒均由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒进行PCR扩增的最佳反应温度和时间为：50℃ 15min，1个循环；95℃ 15min，1个循环；之后94℃ 15s，55℃ 45s，40～50个循环收集荧光信号。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为DEPC水。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述c-MMLV酶用量为1.5~3.5U/人份、热启动Taq酶用量为3~7U/人份、RNasin用量为15~25U/人份、dNTPs浓度为0.20mmlo/L，酶稀释液为一般市售的酶稀释液。

8.根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的待检样品是外周血或骨髓。