[发明专利]一种检测融合基因BCR‑ABL(P210）mRNA表达的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Real-Time Q-PCR检测融合基因BCR-ABL(P210）mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（Real-Time Q-PCR）技术快速、定量检测融合基因BCR-ABL(P210） mRNA的试剂盒。

背景技术

慢性粒细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是一种起源于造血干细胞的恶性增生性疾病，其细胞遗传学特征表现为具有特异性的费城染色体（Philadephis，Ph）。该特异性费城染色体是由t (9；22)(q34；11)易位形成的。9号染色体原癌基因ABL易位至22号染色体的断裂点簇集区(BCR)，发生重排，产生BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因转录为8.5kDa的bcr/abl融合蛋白（P210 bcr/abl），该蛋白具有异常增强的酪氨酸激酶（Tvrosine Kinases，TK）活性， 能使造血干细胞发生异常转化而导致CML的突变。根据BCR断裂点位置的不同分为3个主要类型：M-bcr、m-bcr、μ-bcr，分别编码三种蛋白为：p210蛋白、p190蛋白、p230蛋白。其中95%以上的CML患者表达p210蛋白，急性前B细胞白血病具有BCR-ABL融合蛋白阳性患者中有30%以上表达p210蛋白。因此p210 蛋白不仅在CML患者中表达，也在急性髓系白血病患者中有表达。目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。

Real-TimePCR技术是今年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置（CCD）的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法Real-Time RT-PCR技术是Real-Time PCR的一种（参考文献：Yuqi Z, Min Y, Johann WM et al., Quantification of human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology, J Cli Microbiol, 40（2）：675-678, 2002； Drosten C, Seifried E, Roth WK et al., TaqMan 5-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening, J Clin Microbiol, 39:4302-4308, 2001； Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, et al., Multicenter Comparison of three commercial methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol., 34(12):3016-22, 1996; Christopherson C, Kidane Y, Conway B, et al., PCR-Based assay to quantify human immunodeficiency virus type 1 DNA in peripheral blood mononuclear cells. J Clin Microbiol., 38(2):630-4, 2000.），它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的Real-Time PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。