[发明专利]脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法。本发明提供的培养基能够将脂肪间充质干细胞诱导同时分化成为星状细胞和肝内皮细胞，实验操作简单，干细胞来源广泛。以本发明提供培养基对脂肪干细胞诱导分化的效果要显著优于对照试验，且分化而来的两种细胞都具备其典型功能和表达关键基因。结果表明，本发明提供的培养基诱导分化23天后，有9.6％的细胞分化为肝星状细胞类似的细胞，有14.3％的细胞成为人类肝内皮细胞类似的细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法。

背景技术

在我国每年近28万人死于肝硬化、肝癌等肝脏相关疾病。目前对晚期肝病的临床治疗尚无特效疗法和技术手段，原位肝移植是公认的治疗晚期肝病的有效治疗方法。但是，由于肝源短缺，手术费用昂贵，操作要求高，术后免疫反应等原因，肝移植治疗遇到了瓶颈问题。

干细胞移植治疗就是试图缓解肝源短缺的问题。目前，利用干细胞移植在肝病的治疗中取得了一定的成果，潘兴南、何金秋和Mehdi Mohamadnejad等人利用自体骨髓间充质干细胞临床治疗肝硬化等终末期肝病取得一定的疗效；此外还有干细胞成功治疗骨头坏死、眼疾、耳聋，心脏、血管、肌肉损伤上治疗的报道。但是，干细胞治疗的应用还存在一些难题，比如，临床研究种子细胞主要来源于骨髓或脐血，其来源相对局限，获取的细胞数量较低，且诱导干细胞的生长和分化过程十分复杂，效率较低；其次，骨髓间充质干细胞的质量在较高程度上影响着治疗的效果；且有研究显示，骨髓干细胞移植之后，会明显增加受损肝脏内星状细胞和肌纤维母细胞的数量，这说明骨髓干细胞移植很大程度上会加速，而不是改善肝纤维化的进展。

另外，本领域当前研究的方向主要集中在将干细胞分化成肝细胞，或者不进行分化，直接用干细胞移植后令其在肝内自发分化而起作用；也有研究者将干细胞分化成胆管上皮样细胞。不过该方法有几大缺点，包括分化后仅为肝细胞一种细胞类型、注射细胞仅为2D细胞悬液、治疗效率低和移植后成瘤性等问题。现在有研究创造性地将肝细胞、静脉内皮细胞和间充质干细胞共培养，提示多种相关细胞的混合培养更有利于3D器官芽的形成。但是，虽然肝星状细胞和肝内皮细胞是肝脏细胞的最重要的细胞类型，在肝脏的生理、病理进程中发挥着不可或缺的作用，但目前还没有很成熟、简单且高效的将干细胞在体外诱导分化成这两种细胞的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供脂肪间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞同时分化的培养基及方法，本发明提供的培养基和培养方法能够将脂肪间充质干细胞在体外直接同时诱导分化成为肝星状细胞和肝内皮细胞，操作更加简单。

本发明提供了一种培养基，包括：基础培养基和Wnt3a蛋白20ng/mL～80ng/mL、Activin A蛋白50ng/mL～100ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL～200μL/mL。

本发明中，将该培养基标记为培养基A。

一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白20ng/mL、Activin A蛋白100ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。

一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白20ng/mL、Activin A蛋白100ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 200μL/mL。

一些实施例中，培养基A包括：基础培养基和Wnt3a蛋白80ng/mL、Activin A蛋白50ng/mL、地塞米松1μmol/L、ITS 2.5μL/mL和FBS 50μL/mL。