[发明专利]一种精浆肉碱检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及第二类体外诊断试剂，具体涉及一种精浆肉碱检测试剂盒及其应用。

背景技术

肉碱有左旋(L-)和右旋(D-)两种旋光异构体，分别具有不同的生理和药理性质。L-肉碱是线粒体膜上唯一的活化脂肪酸载体，主要功能是携带、转运活化的脂肪酸，特别是长链饱和和不饱和脂肪酸穿越线粒体膜，进入线粒体内进行β氧化和三羧酸循环反应，为机体的各种代谢活动提供能量。L-肉碱还具有促进丙酮酸、支链氨基酸的氧化利用，清除胞质中乙酰辅酶A的积聚和不良反应，调节和维持线粒体基质中酰基辅酶A与辅酶A之间的比例，防止长链脂酰辅酶A对生物膜的损伤等生物功能。而D-肉碱对肉碱乙酰基转移酶和肉碱脂酰转移酶具有竞争性抑制作用，不利于L-肉碱生物功能的发挥和生物体的正常代谢，对生物体表现出较大毒性。因此，在生物体提到的肉碱一般指L-肉碱。L-肉碱分布于人体内各种组织，以附睾中的浓度最高。目前认为L-肉碱与精子在附睾中的成熟有关。当精液中L-肉碱缺乏时，精子线粒体内正常的β氧化过程缓慢，为精子提供的能量降低，可导致精子存活力和运动能力明显降低，进而可导致男性不育。对因L-肉碱缺乏的患者及时给予L-肉碱已成为目前治疗男性不育的新疗法之一。

目前，文献报道的检测肉碱的方法主要有生物法、化学法、荧光法、高效液相色谱法、放射性同位素酶法等。高效液相色谱法：采用对溴苯乙酰基溴紫外衍生化技术，结合正相色谱分离，以Lichrospher SiO₂为固定相，乙腈-柠檬酸缓冲液为流动相进行色谱等度分离，260nm波长下定量检测精浆中L-肉碱含量。该方法检测回收率高，检测结果准确；缺点是样本处理复杂，仪器价格昂贵，检测时间长，难以适应医疗机构检测大批样本的需求。生物法：Fraenkel和Friedman通过对大黄粉虫喂食含有L-肉碱的饲料，通过观察其生存状况测定L-肉碱含量的方法，该方法耗时长、误差大，影响因素比较复杂。放射性同位素酶法：¹⁴C标记的乙酰辅酶A+L-肉碱→¹⁴C标记的L-肉碱+游离辅酶A，该方法中由于放射性同位素的使用，对检测人员的操作和检测环境要求严格。荧光法：L-肉碱与NAD⁺在肉碱脱氢酶的作用下生成脱氢肉碱、NADH和H⁺；NADH、H⁺和刃天青在硫辛酰胺脱氢酶作用下反应生成荧光物质试卤灵；在恒定反应条件下，试卤灵的荧光强度与肉碱的含量成正比，因此可以通过试卤灵的荧光强度变化测出肉碱的含量；该方法比较灵敏，检测结果准确，但检测结果易受样本中肉源性荧光物质的干扰。化学法：肉碱在酸性条件下与乙醇反应生成酯，酯在弱碱性条件下与溴酚蓝生成有色物质，其颜色深浅与肉碱的浓度呈正比。该方法为手工方法，加样程序多，操作步骤复杂，不但耗时耗力，而且人为误差较大，因此大大限制了其在临床上的广泛应用。

鉴于以上方法的优缺点，再结合目前临床上并没有有效、简便的适合大批量检测精浆肉碱的检测方法，临床上给予肉碱缺乏症患者左卡尼汀(主要成分为肉碱)只是一种经验性的治疗。同时临床上的多种生化项目检查已基本实现了全自动化，因此建立一种与全自动生化分析仪相配套使用的精浆肉碱检测试剂盒就显得尤为迫切和重要。

发明内容

发明目的：本发明提供一种精浆肉碱检测试剂盒，该试剂盒适用于临床大批量精浆肉碱样本检测，在检测精浆肉碱时，线性范围宽，基质效应小、准确度高、重现性好。

本发明还提供了一种精浆肉碱检测试剂盒的应用，该试剂盒可以在全自动生化分析仪上的应用，可以与精浆生化的其他项目在全自动生化分析仪上共用同一份标本同时检测。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种精浆肉碱检测试剂盒，包括R1冻干粉、R2试剂、校准品和冻干精浆质控品；所述R1冻干粉由DTNB、乙酰辅酶A和乙二胺四乙酸二钠溶解在磷酸盐缓冲溶液中冻干获得；所述R2试剂为肉碱乙酰转移酶溶解在磷酸盐缓冲溶液中；所述的校准品为肉碱国家标准品溶于硫酸庆大霉素溶液中；所述冻干精浆质控品为定值的精浆肉碱冻干粉。

其中，所述R1冻干粉冻干前，溶液中DTNB、乙酰辅酶A和乙二胺四乙酸二钠的最终浓度分别为0.01～1mmol/L、0.025～0.15mg/ml和0.1～0.5mmol/L。

所述R2试剂中肉碱乙酰转移酶活性为350～2000U/L。