[发明专利]载脂蛋白II/I及其制备方法、生物学功能及应用

权利要求书

1. 天然载脂蛋白II/I，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID：2所示。

2. 重组载脂蛋白II/I活性片段，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID：3-6所示。

3.如权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I的制备方法，其特征在于：

收取柞蚕血淋巴，12000×g离心后取上清，进行40%硫酸铵沉淀；离心取沉淀用50mM 柠檬酸缓冲溶液pH5.2，100mM NaCl, 5%甘油进行复溶；离心后取上清，过Sephacryl S-200柱，收集含有目的蛋白的流出组分；该组分用50mM PB pH8.0透析后，经HiTrapTM SP柱以0-1M NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的流出组分。

4.如权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I的制备方法，其特征在于：

柞蚕血淋巴使用70%硫酸铵沉淀，然后于4°C，8000×g离心15min，弃上清沉淀用50mMMES，200mM NaCl，2mM DTT，5%甘油，pH6.2复溶并透析，透析后样品过磷酸纤维素柱，用200mM-600mM NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的组分；上述组分用50mM MES，100mM NaCl，2mM DTT，5%甘油，pH6.2透析，透析后样品于4°C，8000×g离心15min，除去沉淀，上清组分过Mono S柱，用150mM-600mM NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白组分上述组分过SuperdexTM200柱， 50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5%甘油，pH6.2 ，收集含目的蛋白组分。

5.如权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I的制备方法，其特征在于：

柞蚕血淋巴使用70%硫酸铵沉淀，然后于4°C，8000×g离心15min，弃上清沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶，上羟基磷灰石柱，用磷酸根离子梯度洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分用磷酸盐缓冲溶液透析，上阴离子交换柱HiTrapTM Q，使用NaCl浓度梯度进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分添加(NH₄)₂SO₄至浓度为2M，上苯基疏水柱，使用(NH₄)₂SO₄浓度降低梯度进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分上凝胶过滤柱Sephacryl S-100，收集含目的蛋白组分。

6.权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段的重组表达产物的基因表达方法，其特征在于，它包括（1）利用基因工程技术表达载脂蛋白II/I活性片段（2）从上述表达体系中分离纯化重组的载脂蛋白II/I活性片段，上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组载脂蛋白II/I活性组分，上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯或HPLC纯度的重组载脂蛋白II/I活性片段。

7.如权利要求6所述的基因表达方法，其特征在于，所述的基因表达体系包括（1）原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，（2）昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备重组载脂蛋白II/I活性片段的来源。

8.权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I或权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段在制备特异性识别Lys-肽聚糖、DAP-肽聚糖以及脂磷壁酸的微生物相关分子模式的检测试剂中的应用。

9.权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I或权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段在制备革兰阳性菌和部分真菌、革兰阴性菌的检测试剂中的应用。