[发明专利]一种黑曲霉的复合诱变方法

权利要求书

1.一种黑曲霉的复合诱变方法，其特征在于所述方法为在黑曲霉原生质体上进行常压室温等离子体诱变，具体包括如下步骤：

(1)孢子预培养；(2)菌体酶解脱壁；(3)常压室温等离子体诱变；(4)原生质体再生培养；(5)24孔板筛选；(6)摇瓶发酵复筛。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中孢子预培养的方法为：从活化培养好的斜面收集孢子，并以10⁶个/mL的接种量接种到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培养16h，然后收集菌球。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的具体方法为：将菌球用KMC液洗涤2～3次后过滤，然后加入50mL溶壁酶和几丁质酶溶液，混匀，置于37℃水浴保温处理2h后，4℃2000g离心10min，弃上清液，用KMC液洗涤2次除去细胞壁酶解液，将原生质体悬浮于100μL KMC液中备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)的具体方法为：将原生质体悬液吸取10μL置于载片上，常压室温等离子体诱变处理120s，工作条件为：气体流量10slm，照射功率100W。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)的具体方法为：将原生质体用KMC液系列梯度10-10⁵倍，吸取100μL原生质体稀释液于再生固体培养基中进行再生培养，培养条件35℃培养36h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中24孔板筛选的方法为：将在原生质体再生培养基上生长起来的单菌落待长出浓密孢子，用24孔板进行初筛。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括步骤(7)传代稳定性检测，即：将孢子制备含15％甘油的冻存管，冻存于-80℃，活化培养并以此为第一代；从第一代斜面种刮取孢子液，稀释后涂布于固体培养基35℃培养24h至长出单菌落，将单菌落转接到新的斜面培养，此为第二代；从第二代斜面刮取孢子液，稀释后涂布于固体培养基35℃培养24h至长出单菌落，将单菌落转接到新的斜面培养，此为第三代；以此类推，传至第20代，将20代菌株进行摇瓶发酵试验，并检测发酵液柠檬酸产率。