[发明专利]一种黑曲霉的复合诱变方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌种的诱变选育技术领域，尤其是涉及一种一种原生质体与常压室温等离子体诱变复合选育黑曲霉柠檬酸高产菌株的方法。

背景技术

柠檬酸具有广阔的应用前景和市场需求。出于经济层面考虑，一部分研究在现有菌种的基础上利用价格更低廉的粗糖原料以及农业废渣来生产柠檬酸，而另一部分研究则致力于改良菌种。生产菌种的改造和选育是柠檬酸发酵工业的基础，决定了发酵过程的成败和发酵产品工业化生产的价值。我国是柠檬酸生产大国，虽然柠檬酸转化率已经接近理论水平，产量可以达到170g/L，但发酵周期偏长，工业生产发酵周期普遍为72h，工业发酵水平还有待提高。

目前，国内的黑曲霉生产菌株均由诱变育种获得，常用的诱变方法为化学诱变(硫酸二乙酯、亚硝基胍和氯化锂等)和物理诱变(紫外、⁶⁰Co等)。化学诱变剂主要通过与碱基结合形成加合物以及造成DNA烷基化引入变异，紫外则通过使DNA分子形成环丁烷嘧啶二聚体阻碍碱基间的正常配对造成核酸变异。这些诱变操作存在安全性风险，此外诱变效率可控性有限。常压室温等离子体诱变是最近发展起来的技术，电子在射频电场作用下获得能量，通过碰撞，与周围中性粒子发生能量交换，使其分解、激发或电离，在两级电压作用下，气体被击穿产生放电，形成具有一定电离度的等离子体。通过高浓度的中性活性粒子会造成细胞的亚致死效应，使核酸出现开环、断裂、破碎现像，再利用细胞自身的DNA修复机制，实现胞内遗传物质的变化。此外，等离子体产生的活性氧成分(reactive oxygenspecies，ROS)由于细胞膜通透性增强而进入细胞，也进一步造成DNA损伤。因此等离子诱变可以同时造成基因突变和染色体变异,有望获得高产黑曲霉柠檬酸生产菌株。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种黑曲霉的复合诱变方法。本发明方法使用设备简单、操作方便、诱变效率高。

本发明的技术方案如下：

一种黑曲霉的复合诱变方法，所述方法为在黑曲霉原生质体上进行常压室温等离子体诱变，具体包括如下步骤：

(1)孢子预培养；(2)菌体酶解脱壁；(3)常压室温等离子体诱变；(4)原生质体再生培养；(5)24孔板筛选；(6)摇瓶发酵复筛。

所述步骤(1)中孢子预培养的方法为：从活化培养好的斜面收集孢子(将-80℃冻存的黑曲霉甘油管种转接到斜面培养基进行活化培养，34-37℃培养6天，活化2次)，并以10⁶个/mL的接种量接种到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培养16h，然后收集菌球。

所述斜面培养基配方：麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，琼脂1.5％，121℃灭菌15min。

所述步骤(2)的具体方法为：将菌球用KMC液洗涤2～3次后过滤，然后加入50mL溶壁酶和几丁质酶溶液，混匀，置于37℃水浴保温处理2h后，4℃2000g离心10min，弃上清液，用KMC液洗涤2次除去细胞壁酶解液，将原生质体悬浮于100μL KMC液中备用。

所述KMC液：0.7M KCl，50mM CaCl₂，20mM Mes/NaOH，pH 5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用；

所述细胞壁酶解液：5mg/mL溶壁酶、0.2U/mL几丁质酶，0.22μM无菌过滤器除菌。

所述步骤(3)的具体方法为：将原生质体悬液吸取10μL置于载片上，常压室温等离子体诱变处理120s，工作条件为：气体流量10slm，照射功率100W。

所述步骤(4)的具体方法为：将原生质体用KMC液系列梯度10-10⁵倍，吸取100μL原生质体稀释液于再生固体培养基中进行再生培养，培养条件35℃培养36h。

所述原生质体再生培养基配方：麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，1.2M山梨醇，1％的琼脂，121℃灭菌15min。

所述步骤(5)中24孔板筛选的方法为：将在原生质体再生培养基上生长起来的单菌落待长出浓密孢子，用24孔板进行初筛；具体步骤包括：

①种子培养：每个孔装3mL种子培养基，接种1个菌株，35℃，180rpm培养24h；所述种子培养基为玉米清液和混液按比例混合，总糖含量10％，总氮含量0.2％；