[发明专利]一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β‑葡萄糖苷酶的发酵工艺

说明书

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用，此外，β-葡萄糖苷酶能将果、蔬、茶中的风味前提物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，还能协助纤维素酶降解纤维素。因此，β-葡萄糖苷酶在食品、发酵领域均有重要的应用价值。

巴斯德毕赤酵母（pachia pastoris）是一种能高效表达外源蛋白的表达系统，具有遗传稳定、表达水平高、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点。为此，巴斯德毕赤酵母作为基因工程菌株，在酶制剂行业得到了广泛的应用。然而在以甲醇作为碳源诱导产酶时，甲醇经常不能很好的控制补料，经常出现两种情况：一是甲醇补料过低，菌体得不到充足的碳源，导致菌体浓度和产酶量下降；二是甲醇补料过量，导致菌体生长停滞甚至死亡。这两种情况严重影响巴斯德毕赤酵母在以甲醇作为诱导物产酶时的产量，此外，巴斯德毕赤酵母在发酵生产β-葡萄糖苷酶过程中，大量的β-葡萄糖苷酶会吸附在巴斯德毕赤酵母上，导致在提取过程中收率较低。因此，开发一种产品收率较高的利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：为克服上述背景技术中提到的甲醇补料不稳定及毕赤酵母产β-葡萄糖苷酶提取收率低的技术问题，提供一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺，该工艺包括一种甲醇补料策略，具体为：

；其中，Y为甲醇补料量（L/h）；a为发酵液起始体积（L）；系数b的范围：0.006-0.06；系数c的范围：0.00085-0.002，x为补料时间（h）；该补料策略可使发酵液中甲醇浓度控制在10-20 g/L。

进一步限定，上述技术方案中所述的补料策略为：

；当a=100L，控制发酵罐的溶氧在20-45%时，该补料策略可使发酵液中甲醇浓度控制在10-15.4 g/L。

进一步限定，上述技术方案中，当a=100L时，补料时间和甲醇补料量（x，Y）存在如下较优点，（x∈（1-4）,0.8），（5,0.95），（6,1.1），（7,1.25），（8,1.4），（9,1.55），（10,1.7），（11,1.85），（12,2），（x∈（13-120），2.15）。

一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺，该发酵工艺在发酵结束后，向产β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母发酵液中添加质量百分比为5-20%的氯化钠溶液，在0-400 rpm/min搅拌3-16 h，加入质量百分比为10-25% 的硅藻土溶液进行板框过滤。

进一步限定，上述技术方案中发酵结束后，向产β-葡萄糖苷酶毕赤酵母发酵液中添加质量百分比10%的氯化钠溶液，200 rpm/min搅拌12 h，后加入质量百分比20%的硅藻土溶液进行板框过滤。

有益效果：与现有技术相比，采用本发明的技术方案能有效克服现有工艺中甲醇诱导产β-葡萄糖苷酶时容易出现的发酵液浓度过低或过高严重影响毕赤酵母生长及产β-葡萄糖苷酶能力的问题，能很好控制发酵液中甲醇浓度在10-20g/L，使菌体快速繁殖，且高效表达β-葡萄糖苷酶；同时通过改进提取工艺，解决β-葡萄糖苷酶提取收率低的问题，使提取收率达到71%，具有较大的工业应用价值，适宜进一步推广应用。

具体实施方式

下面所示的实施例不对权利要求所记载的发明内容起任何限定作用，并且，下面实施例所表示构成的全部内容不限于作为权利要求所记载发明的解决方案所必须的。下述实施例中涉及β-葡萄糖苷酶的测定和甲醇的测定，其中β-葡萄糖苷酶的测定方法具体如下：

试剂准备：

（1）缓冲液：