[发明专利]一种快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法及引物对

说明书

技术领域

本发明属于昆虫抗药性鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法及引物对，即利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)灵敏的快速检测小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗药性水平，可用于小菜蛾对双酰胺类杀虫剂产生抗药性田间种群的早期诊断及抗药性水平、抗性频次的监测和鉴定。

背景技术

小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是为害十字花科蔬菜的世界性重要害虫，常对十字花科蔬菜的生产造成毁灭性破坏。化学农药是小菜蛾的主要防治措施，大量化学杀虫剂的长期使用和滥用，致使其抗性水平不断提高，抗性谱不断扩大，几乎对所用过的杀虫剂都产生了抗药性，不但严重削弱了当前化学杀虫剂对其为害的控制作用，还导致了化学农药更大剂量的使用和滥用，引起了农产品中农药残留超标和环境污染等一系列食品和环境安全问题，成为我国十字花科蔬菜生产过程中亟待解决的主要问题之一。

双酰胺类杀虫剂是农业生产中控制小菜蛾等鳞翅目害虫田间为害的主要武器。作为双酰胺类杀虫剂的代表，氯虫苯甲酰胺以其作用机理独特，对靶标害虫高效，对哺乳动物低毒、安全，无交互抗性和对环境友好等其他农药不可比拟的优点，成为杀虫剂发展史上的又一个新突破，具有划时代意义。但是，氯虫苯甲酰胺在田间大面积推广应用2年后国内外相继报道了小菜蛾抗药性种群的产生和发展。广东省农业科学院植物保护研究所亦于2011年6月首次在国内报道了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺产生高抗药性的田间种群。随后有关小菜蛾氯虫苯甲酰胺抗性种群田间扩散的报道不断增多。小菜蛾对氯虫苯甲酰胺高抗药性的产生和发展，使得该药剂对小菜蛾田间种群的防控效果大大降低，有些蔬菜生产基地完全失效，一时之间防控小菜蛾的当家药品缺失，我国部分十字花科作物生产区小菜蛾暴发成灾，给十字花科蔬菜的安全生产和发展造成了严重影响。实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、精度高、取样量微小、检测时间短等优点，对小菜蛾抗药性治理、保障我国十字花科蔬菜的安全生产和发展具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的引物对。

本发明的另一目的在于提供一种用于快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法。

本发明提供一种快速检测小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的分子快速检测技术。该技术操作简便易行，可以以试剂盒的形式直接应用于生产实践，用于小菜蛾田间种群对双酰胺类杀虫剂抗药性的监测，对小菜蛾田间种群抗双酰胺类杀虫剂水平的监测与预警具有十分重要的意义。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的引物对，所述的引物对的序列：

上游引物PXRyRF：5′-TGCCATTATTCAAGCCACCCCC-3′；

下游引物PXRyRR：5′-GCAAGTCGCGTAAATCCAAAAC-3′。

一种用于快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的试剂盒，包括上述所述的引物对。

一种快速鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法，包括以下步骤：

(1)设计PCR引物，其中：

上游引物PXRyRF：5′-TGCCATTATTCAAGCCACCCCC-3′；

下游引物PXRyRR：5′-GCAAGTCGCGTAAATCCAAAAC-3′；

(2)提取待测小菜蛾样本RNA，RNA反转录成cDNA后以cDNA为模版，进行qPCR扩增；

(3)当步骤(2)中所述qPCR扩增结果RQ值≤0.5时，表明所测样品对双酰胺类杀虫剂已产生高抗药性。

步骤(2)中所述的待测小菜蛾样本为室内敏感品系和田间种群小菜蛾3龄幼虫；

步骤(2)中所述的提取待测小菜蛾样本RNA的处理方式优选为异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提样本RNA；

步骤(2)中所述qPCR扩增中的程序设定为：95℃预变性15分钟；95℃变性10秒，55.0℃退火20秒，72℃延伸20秒，40个循环；溶解曲线95.0℃15秒，65.0℃5秒，95℃5秒。

步骤(3)中所述的RQ值＝2^-△△Ct(田间种群)/2^-△△Ct(室内敏感)。