[发明专利]一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法

权利要求书

1.一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，包括：

草莓无菌苗的预培养：取草莓无菌苗，获得其叶盘或剪成小块，置于M1培养基中进行暗培养，获得预培养叶片；

农杆菌活化：取根癌农杆菌阳性单克隆于含抗生素的YEB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养，获得菌液；取获得的菌液离心收菌，获得菌体沉淀；将获得的菌体沉淀重悬于M2培养基中，振荡培养，获得用于侵染的菌液；

侵染：将获得的所述预培养叶片置于所述用于侵染的菌液中，进行侵染处理；

共培养：吸干经侵染处理后的叶片表面的菌液，置于M3培养基中，进行暗培养；

延迟筛选：用M4洗涤液洗涤经共培养结束后的叶片，并吸干其表面的菌液，再接种于M5培养基上，进行暗培养；

筛选：将延迟筛选结束后的叶片转移至M6培养基中，光照和黑暗交替培养，培养结束后，切除坏死组织，将俞伤组织部分转接于M7培养基中，再光照和黑暗交替培养，直到分化出不定芽；

生根：待芽长长后，将其切下转移至M8培养基中再培养，得到完整植株。

2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述根癌农杆菌为LBA4404农杆菌或GV3101农杆菌。

3.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述M3培养基的成分包括MS无机盐、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值为5.5。

4.根据权利要求3所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述M5培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井冈霉素A，且其PH值为5.8。

5.根据权利要求1至4任一项所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述M1培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶和0.1～3mg/L激素；且其PH值为5.8。

6.根据权利要求1至4任一项所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述M2培养基的成分包括MS、B5维生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值为5.5。

7.根据权利要求1至4任一项所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述M4洗涤液的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值为5.8。

8.根据权利要求1至4任一项所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述M6、M7培养基的成分均包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素及200～500mg/L抗生素，且M6、M7培养基的PH值均为5.8；其中所述M6中，所加入的抗生素包括5mg/L的潮霉素或10mg/L的硫酸卡那霉素，所述M7中，所加入的抗生素包括10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。

9.根据权利要求1至4任一项所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，所述M8培养基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH为5.8。

10.根据权利要求1至4任一项所述的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其特征在于，在延迟筛选培养中，接种于M5培养基上进行培养的条件是22℃条件下暗培养6天；在筛选培养中，所述光照和黑暗交替培养具体为16小时的光照培养和8小时的黑暗培养交替培养15～20天，在交替培养15～20天后再重复筛选培养过程一次。