[发明专利]一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物学技术领域，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法。

背景技术

根癌农杆菌介导法是草莓遗传转化的重要方法，它是以草莓的叶片、叶柄、原生质体和愈伤组织等为外植体，经农杆菌浸染后，通过抗生素筛选、器官发生获得再生植株，其中以“叶盘法”应用的最为普遍。

传统的“叶盘法”存在遗传转化效率低、杂菌污染严重、不定芽再生困难、容易产生嵌合体和假阳性植株等问题，从而导致筛选工作量大、转基因植株获取困难。而随着草莓基因组学研究的深入，揭示基因功能及其表达时空性已成为后基因组时代的重要课题，转基因技术作为研究基因功能的最有效的手段之一已发挥着越来越重要的作用。因此，建立一种高效稳定的草莓遗传转化方法对批量验证基因功能就显得尤为重要。

发明内容

为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法，其优化了遗传转化的步骤，从而大幅度提高了草莓转基因效率，解决了传统农杆菌介导法转化效率低，易产生嵌合体，筛选困难，工作量大的问题，极大的提高了遗传转化效率，同时显著降低了再生芽的假阳性率。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其包括：

草莓无菌苗的预培养：取草莓无菌苗，获得其叶盘或剪成小块，置于M1培养基中进行暗培养，获得预培养叶片；

农杆菌活化：取根癌农杆菌阳性单克隆于含抗生素的YEB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养，获得菌液；取获得的菌液离心收菌，获得菌体沉淀；将获得的菌体沉淀重悬于M2培养基中，振荡培养，获得用于侵染的菌液；

侵染：将获得的所述预培养叶片置于所述用于侵染的菌液中，进行侵染处理；

共培养：吸干经侵染处理后的叶片表面的菌液，置于M3培养基中，进行暗培养；

延迟筛选：用M4洗涤液洗涤经共培养结束后的叶片，并吸干其表面的菌液，再接种于M5培养基上，进行暗培养；

筛选：将延迟筛选结束后的叶片转移至M6培养基中，光照和黑暗交替培养，培养结束后，切除坏死组织，将俞伤组织部分转接于M7培养基中，光照和黑暗交替培养，直到分化出不定芽；

生根：待芽长长后，将其切下转移至M8培养基中再培养，得到完整植株。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述根癌农杆菌为LBA4404农杆菌或GV3101农杆菌。

进一步，所述M3培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值为5.5。

采用上述进一步方案的有益效果是：利用含有上述成分的M3培养基，通过加入适宜浓度的а-硫辛酸，能够缓解农杆菌浸染植物过程中产生的“氧爆反应”，清除活性氧和自由基，减缓植物组织的褐化，促进转基因芽的再生。

进一步，所述M5培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井冈霉素A，且其PH值为5.8。

采用上述进一步方案的有益效果是：在草莓遗传转化过程中添加适宜浓度的а-硫辛酸和井冈霉素A，极大的提高了遗传转化效率，同时显著降低了再生芽的假阳性率，转化效率是传统的农杆菌介导法的两倍以上。

进一步，所述M1培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶和0.1～3mg/L激素；且其PH值为5.8。

进一步，所述M2培养基的成分包括MS、B5维生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值为5.5。

进一步，所述M4洗涤液的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值为5.8。

进一步，所述M6、M7培养基的成分均包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素及200～500mg/L抗生素，且M6、M7培养基的PH值均为5.8；其中所述M6中，所加入的抗生素包括5mg/L的潮霉素或10mg/L的硫酸卡那霉素，所述M7中，所加入的抗生素包括10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。

进一步，所述M8培养基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH为5.8。