[发明专利]一种RNA高通量测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)进行末端延伸反应，使不带poly(A)尾的RNA在3’末端延伸出一段序列；(2)进行连接反应，使上述RNA在其5’端连接上接头R5A，得到RNA连接产物；(3)对上述RNA连接产物进行纯化；(4)利用特异的逆转录引物RTP对上述纯化后的RNA连接产物进行逆转录反应，获得相应的cDNA一链；(5)进行PCR扩增富集，即得到高通量测序文库。

2.根据权利要求1所述的RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，3’端延伸序列为一段同聚物序列。

3.根据权利要求2所述的同聚物序列，其特征在于同聚物由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)这五种碱基中的任意一种组成，优选地为碱基A。

4.根据权利要求1所述的NRA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，5’端接头R5A由两段序列构成：5’端的一段特异序列和3’端的一段唯一识别序列。

5.根据权利要求4所述的5’端接头R5A，其特征在于，5’端特异序列为高通量测序平接头的3’端序列或完整全长序列。

6.根据权利要求4所述的5’端接头R5A，其特征在于，3’端唯一识别序列为由A、T、C和G这四种碱基组成的随机序列，长度为5nt。

7.根据权利要求5及权利要求6所述的5’端接头R5A，其特征在于，其序列包含Seq IDNo:1。

8.根据权利要求1所述的RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，逆转录引物RTP由5’端的特异序列和3’端的特异序列两部分序列构成。

9.根据权利要求7所述的逆转录引物RTP，其特征在于，5’端的特异序列为高通量测序平台接头的3’端序列或完整全长序列。

10.根据权利要求7所述的逆转录引物RTP，其特征在于，3’端的特异序列由RNA连接产物捕获序列和锚定序列两部分组成。

11.根据权利要求10所述的RNA连接产物捕获序列，其特征在于，该序列由与RNA 3’端延伸序列相互补的碱基组成。

12.根据权利要求10所述的RNA连接产物捕获序列，其特征在于，该序列的长度为2-50nt，优选地为10-30nt。

13.根据权利要求10所述的锚定序列，其特征在于，其第1位碱基(从5’端到3’端方向)为不与RNA同聚物互补的简并碱基。

14.根据权利要求10所述的锚定序列，其特征在于，其第2位碱基(从5’端到3’端方向)到3’最末端的序列由A、T、C和G这四种碱基随机组成。

15.根据权利要求10所述的锚定序列，其特征在于，该序列长度为1-5nt，优选地为1-3nt，更优选地为1nt。

16.根据权利要求9和权利要求10所述的逆转录引物RTP，其特征在于，其序列包含SeqID No:2、Seq ID No:3、Seq ID No:4和Seq ID No:5。

17.根据权利要求1所述的RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，用于文库扩增的PCR引物为高通量测序平台接头的5’端序列或完整全长序列。

18.根据权利要求1所述的RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，该方法能够对所有的不带poly(A)尾的RNA进行高通量测序文库构建，包括线性的不带poly(A)尾的RNA和环状RNA。

19.根据权利要求19所述的RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，针对线性的不带poly(A)尾的RNA，可以直接利用本发明方法或在进行打断后进行高通量测序文库构建；非线性的不带poly(A)尾的RNA在打断后，可以利用该方法进行高通量测序文库构建。