[发明专利]一种RNA高通量测序文库的构建方法

说明书

本发明提供一种能够对所有不带poly(A)尾的RNA进行高通量测序文库构建的方法，本发明方法覆盖所有不带poly(A)尾的RNA，包括线性RNA和环状RNA。线性的不带poly(A)尾的RNA，可以直接利用本发明方法或在打断后进行高通量测序文库构建；环状RNA在打断后，可以利用本发明方法进行高通量测序文库构建。首先，进行末端延伸反应，使上述的RNA在3’末端延伸出一段同聚物序列。然后，进行连接反应后，使其5’端连接上接头R5A。待连接反应后，对上述RNA连接产物进行纯化，再利用特异的逆转录引物RTP进行逆转录反应，获得相应的cDNA一链。最后，利用与高通量测序平台匹配的引物进行PCR扩增，即可得到高通量测序文库。值得一提的是，本发明方法在灵敏度上得到了较大提升，尤其适用于微量样品中低起始量RNA的高通量测序文库的构建。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种不带poly(A)尾的RNA的高通量测序文库的构建方法，特别涉及微量样品如外泌体及细胞外囊泡中低起始量RNA的高通量测序文库的构建。

技术背景

小分子RNA(small RNA)是一大类调控分子，存在于几乎所有的生物体中，其长度一般为18-40个核苷酸(nucleotide，nt)。自1993年首次在秀丽线虫(Caenorhaditselegans)中发现small RNA后，人们越来越多地意识到small RNA的重要作用。它们以不同于“经典RNA”的作用方式，参与基因表达与调控、RNA的加工与剪切、蛋白质翻译、遗传“入侵”抑制、配子发生等生物学过程，在基因表达、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程起着重要的作用。根据小RNA的分子特征，可以为为4类：微小RNA(microRNA，miRNA)、piRNA(piwi-associated RNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和核仁小RNA(snoRNA,small nucleolar RNA)，其中miRNA的研究较多，进展最快。

作为典型的线性的不带poly(A)尾的RNA，miRNA是一类长度为19-25nt的小分子RNA，最早在线虫中发现。lin-4和let-7这2种miRNA通过部分序列互补结合到靶mRNA的3’非编码区，调控线虫发育过程。在高通量测序技术诞生之前，miRNA的发现和研究速度一直较慢，这是由于传统的Sanger测序法操作复杂，花费大，测序深度有限，效率较低。自2005年以来，高通量测序技术被广泛用来发掘miRNA。高通量测序技术具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优点，因此非常适合miRNA测序，尤其是对那些拷贝数低的miRNA。截止2016年12月，Sanger microRNA序列数据库miRBase(http://www.mirbase.org/)已经收录2800多种miRNA，其中人类成熟体miRNA有2500多种。研究表明，miRNA的异常表达与特定的癌症、疾病的发生和发展相关。在肿瘤研究领域，利用高通量测序手段，对miRNA的表达谱进行分析，寻找某些肿瘤中可能出现异常表达的miRNA，就可能找到作为肿瘤诊断和预后判断的新型生物标志物。当前，以高通量测序技术结合生物信息学分析已成为研究miRNA的一个非常重要的手段。

与线性RNA相比，环状RNA(circular RNA,circRNA)受到的关注比较少，也比较难于研究。环状RNA是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成。环状RNA很难与其它RNA区分开，扩增或片段化会破坏RNA环，而且早期RNA测序的分析算法会过滤掉环状RNA的标志性序列。由于技术和方法学问题，环状RNA一直被视为是罕见的剪切错误，从而把这部分客观存在的RNA忽略了。随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。