[发明专利]从蛋壳中共纯化三种微量功能蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化制备技术领域，具体地指一种从蛋壳中共纯化三种微量功能蛋白的方法。

背景技术

目前，具有生物矿化与结晶等重要功能的蛋白质仅在蛋壳中发现较多，例如卵壳矿化蛋白-17(Ovocleidin-17，OC-17),卵壳强化蛋白-116(Ovocleidin-116，OC-116)和卵壳脂合蛋白-36(Ovocalyxin-36，OCX-36)等，这些蛋白质不仅具有卓越的生物矿化与结晶功能，还具有生物结合、催化、酶调制、生物矿化、抗菌、分子传导与结构分子转运、通道调控等重要功能，在生物、医药、食品、材料等领域具有极其广阔的应用前景。

但这些蛋白在蛋壳中含量很少，研究表明OC-17、OC-116和OCX-36主要存在于蛋壳中，分别占蛋壳重量的0.4‰，0.8‰，1‰，由于含量极低，提取十分困难，富集方法难度很高，而传统的酸法提取蛋壳蛋白会对蛋白活性造成不同程度的损伤，所以，有必要开发一种温和地提取方法。另外，目前的蛋壳蛋白纯化仅仅分离纯化单一的蛋白，国内外极少有联合提取多种蛋白的研究报道，因此存在浪费蛋壳资源、提取效率低、能源损耗大等诸多缺陷，从而进一步限制了这些蛋白质的研究应用。一旦突破以上技术瓶颈，不仅能充分利用极其丰富的蛋壳资源，在生物医药、材料、轻工、功能食品等领域发挥巨大的商业应用价值，还能防止蛋壳废弃对环境的污染，具有重大的经济社会效益。

发明内容

本发明的目的是针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种从蛋壳中联合提取三种微量功能蛋白的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种从蛋壳中联合提取三种微量功能蛋白的方法，包括以下步骤：

1)新鲜的蛋壳清洗干净，烘干后粉碎，得到蛋壳粉，

2)将蛋壳粉和水混合并搅拌，收集下层沉淀，烘干后即得脱去蛋壳膜的蛋壳粉；

3)向步骤2)所得脱去蛋壳膜的蛋壳粉中加入中性缓冲液提取，搅拌10～30小时，收集上清液，即得蛋壳蛋白粗提液；

4)将阴离子交换层析柱、阳离子交换层析柱进行串联，将步骤3)所得的上清液上柱，用平衡液洗脱1～3倍柱体积，使蛋壳蛋白质与离子交换层析柱中的填料结合；

5)将串联的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱拆开，分别进行洗脱并收集洗脱峰；

6)将收集到的各洗脱峰进行透析脱盐和冷冻干燥，其中，阳离子交换层析柱的洗脱峰即为Ovocleidin-17，阴离子交换层析柱的第一个洗脱峰即为Ovocalyxin-36，第二个洗脱峰即为Ovocleidin-116。

进一步地，所述步骤1)中，烘烤的温度为25～35℃，时间为12～24h，蛋壳粉碎粒度为50～300目。

再进一步地，所述步骤2)中，蛋壳粉与水的质量比为1:5～20。

再进一步地，所述步骤3)中，所述中性缓冲提取液是磷酸盐缓冲液。

再进一步地，所述步骤3)中，蛋壳粉与磷酸盐缓冲液的质量比为1:5～20，磷酸盐缓冲液pH值5.5～8.5。

再进一步地，所述步骤3)中，搅拌提取时间为24～32h。

再进一步地，所述步骤4)中，平衡液为50～200mM的Tris-HCl，pH 6.8～8.8。

再进一步地，所述步骤5)中，阴离子交换层析柱的洗脱液为pH值6.2～7.8、盐浓度0.1～0.5mol/L、还原剂0.5～5mmol/L的缓冲液。

再进一步地，所述步骤5)中，阳离子交换层析的洗脱液为pH值6.8～8.8、盐浓度0.1～0.5mol/L、还原剂0.5～5mmol/L的缓冲液。

再进一步地，所述还原剂为二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。

本发明方法条件选取

1)前处理条件的选择

(1)蛋壳粉碎粒度试验：设置50目、100目、200目、300目粒度处理，其他条件相同情况下，比较各处理的蛋壳回收率，变化趋势见图。粒度在100目的时候有较高的蛋壳回收率，鉴于此，蛋壳粉选用100目粒度(如图2所示)。

(2)料液比试验：设置蛋壳粉与水料液比为1:5、1:10、1:15、1:20，其他操作条件下，比较各处理的蛋壳回收率，变化趋势如图3。料液比1:10时蛋壳有较高的回收率。

2)蛋白质提取方法条件的选择

(1)提取溶液的选择：除提取溶液不同，在相同方法条件提取蛋白质，检测提取液中的蛋白质含量，并根据以下公式计算蛋白质提取率。

蛋白质提取率(％)＝提取液中的蛋白质(g)/蛋壳粉质量(g)×100％