[发明专利]一种基因定点突变载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种基因定点突变载体，其特征在于，所述载体在基础载体的基础上构建，5’到3’包括启动子、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶基因、Cas9基因、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因和终止子；

所述sgRNA表达区含有植物除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列；

用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基础载体为PHEE401E，序列如SEQ IDNo.2所示。

3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述Cas9基因为D10A。

4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体为双元载体。

5.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述启动子是植物内的组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。

6.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶基因来自人类基因组，Cas9基因来自嗜热链球菌，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因来自噬菌体。

7.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列的胞嘧啶3`端方向23个碱基内具有PAM序列NGG。

8.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述植物为粮食和油料作物，包括水稻、棉花、玉米、小麦、大豆、油菜、向日葵；蔬菜作物，包括白菜、甘蓝、黄瓜、番茄；水果作物，包括西瓜、甜瓜、草莓，蓝莓，葡萄；中草药，包括板蓝根、甘草、人参、防风；以及拟南芥；

所述植物除草剂所抑制的酶的相关基因为ALS。

9.一种基因定点突变载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQ ID No.1所示；

2)用步骤1)中CT3替换载体PHEE401E上的Cas9基因，所得载体命名为PHEE401CT；PHEE401E的序列如SEQ ID No.2所示；

3)将除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列克隆到PHEE401CT中的sgRNA表达区，至此PHEE401CT载体构建完成。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中除草剂所抑制的酶的相关基因为拟南芥ALS基因，序列如SEQ ID No.3所示。

11.根据权利要求9或10所述的构建方法，其特征在于，所述除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列如SEQ ID No.4所示。

12.一种抗除草剂植物的制备，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求9所述的PHEE401CT载体转到农杆菌中，通过蘸花法转化植株，通过喷施除草剂获得具有除草剂抗性的植株。

13.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体在植物靶点序列产生C-T的突变。

14.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体还在PAM序列NGG处产生点突变，形成NGA，实现重大农艺性状。