[发明专利]一种基因定点突变载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因定点突变载体及其构建方法和应用。本发明通过大量的优化，提供一种基因定点突变载体，通过CRISPR系统将胞嘧啶脱氨酶引导至胞嘧啶附近，将胞嘧啶变成尿嘧啶，随后植物细胞内的自发修复最终将尿嘧啶变成了胸腺嘧啶，最终在植物中实现C到T的定点突变，产生抗除草剂抗性。另外还可在非sgRNA靶点区域产生点突变，带来新的抗除草剂的重大农艺性状。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因定点突变载体及其构建方法和应用。

背景技术

通过CRISPR-Cas9技术在生物体内进行基因编辑是生命科学领域内的重大突破。在引导RNA(gRNA)的引导下，gRNA-Cas9复合物专一结合与gRNA互补的DNA区域，并切断DNA双链，细胞随即展开修复。如果修复过程中没有可供修复的DNA模板，修复的过程会引入大量的随机突变；如果提供修复模板，就有可能将修复模板整合在DNA中，从而引入设计的突变类型。但是这两种基因编辑方式，都需要将DNA双链切开，且通过修复模板DNA引入，设计突变技术难度很大。

发明内容

本发明的目的是提出一种基因定点突变载体及其构建方法和应用，具体技术方案如下：

一种基因定点突变载体，在基础载体的基础上构建，5’到3’包括启动子、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶基因、Cas9基因、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因和终止子；

所述sgRNA表达区含有植物除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列；

用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQ ID No.1所示。

所述基础载体为PHEE401E，序列如SEQ ID No.2所示；

所述Cas9基因为D10A。

所述载体为双元载体。

所述启动子是植物内的组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。

所述胞嘧啶脱氨酶基因来自人类基因组，Cas9基因来自嗜热链球菌，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因来自噬菌体。

所述除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列的胞嘧啶3`端方向23个碱基内具有PAM序列NGG。

所述植物为粮食和油料作物，包括水稻、棉花、玉米、小麦、大豆、油菜、向日葵；蔬菜作物，包括白菜、甘蓝、黄瓜、番茄；水果作物，包括西瓜、甜瓜、草莓，蓝莓，葡萄；中草药，包括板蓝根、甘草、人参、防风；以及拟南芥；

所述植物除草剂所抑制的酶的相关基因包括ALS、EPSPS、PPO、HPPD、PDS、ACCASE、GS、DOXPS、PsbA。

一种基因定点突变载体的构建方法，包括如下步骤：

1)用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQ ID No.1所示；

2)用步骤1)中CT3替换载体PHEE401E上的Cas9基因，所得载体命名为PHEE401CT；PHEE401E的序列如SEQ ID No.2所示；

3)将除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列克隆到PHEE401CT中的sgRNA表达区，至此PHEE401CT载体构建完成。

步骤3)中除草剂所抑制的酶的相关基因为拟南芥ALS基因，序列如SEQ ID No.3所示。