[发明专利]一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种naive胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)建立同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的转基因阳性动物胎儿成纤维细胞系；

(2)得到转基因阳性的囊胚；

(3)将囊胚内细胞团接种于细胞饲养层；

(4)诱导外源转录因子表达，获得动物胚胎干细胞系，待能够稳定传代后，停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC，获得naive胚胎干细胞。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述动物为有蹄类动物。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述囊胚为发育5-6天的囊胚。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的细胞饲养层为含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液的丝裂霉素预处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，预处理小鼠胎儿成纤维细胞的方法为：38.5℃，5％CO₂培养小鼠胎儿成纤维细胞至汇合度95％时，向含10％血清的DMEM培养液中添加丝裂霉素C处理。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，向含10％血清的DMEM培养液中添加10-15μg/ml丝裂霉素C处理2-3h。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)启动DOX诱导外源转录因子表达；动物胚胎干细胞系培养及传代的培养液为含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液：其100ml培养液中含有：KOSR 50ml，N2B27 50ml，16ng/ml的成纤维细胞生长因子32μl，2000U/ml的LIF 10μl，2μg/ml DOX 40μl；

其中，所述KOSR，以50ml计为：替代DMEM的基础培养基：77％38.5ml；血清替代物:20％,10ml；非必须氨基酸混合液:1％,0.5ml；L-谷氨酰胺:1％2mM,0.5ml；青链霉素双抗：1％,0.5ml；β-巯基乙醇：0.1mM,50μl；CHIR99021：3μM,5μl；PD0325901：1μM,10μl；SB431542：2μM，5μl；抗坏血酸：50ng/ml,5μl；

所述N2B27以50ml计为：DMEM/F12：48％,24ml；神经细胞基础培养基：48％,24ml；N2:1％，0.5ml；B27：2％，1ml；BSA：0.25mg/ml，12.5mg；胰岛素：5μg/ml,25μl；青链霉素双抗：0.5ml；CHIR99021：3μM,5μl；PD0325901：1μM,10μl；SB431542：2μM，5μl；VC：50ng/ml,5μl；

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O₄，分子结构如式(I)所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H18Cl₂N₈，分子结构如式(II)所示：

SB431542为小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子βI型受体活化素受体样激酶ALK5，ALK4和ALK7,分子式C₂₂H₁₆N₄O₃，分子结构如式(III)所示：

8.如权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的方法为：动物胚胎干细胞稳定传代后，将培养液中的DOX由2μg/ml经1μg/ml和0.5μg/ml各一代后降至0，每4-5天消化传代一次。

9.权利要求1-8任一所述的构建方法构建得到的naive胚胎干细胞系。

10.如权利要求9所述的naive胚胎干细胞系在转基因动物制备中的应用。