[发明专利]一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法

说明书

本发明提供了一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法，属于细胞生物学技术领域。本发明将iPSCs技术与传统胚胎干细胞技术相结合首先建立同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc‑MYC的转基因阳性猪胎儿成纤维细胞系；得到转基因阳性的猪囊胚；将囊胚内细胞团接种于细胞饲养层，启动DOX诱导外源转录因子表达，获得猪胚胎干细胞系，待能够稳定传代后，停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc‑MYC，干细胞的干性维持由已经激活的内源pOCT4、pSOX2、pKLF4和pc‑MYC来实现，获得猪naive胚胎干细胞。本发明为转基因克隆猪的研究提供可用于基因遗传修饰和长期培养的干细胞。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体的，涉及猪naive胚胎干细胞的培养和建系方法。

背景技术

Naive胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是由囊胚内细胞团(inner cellmass，ICM)而来的真正的全能干细胞，具有无限自我更新和分化能力(Nichols J，2009，Cell stem cell4(6):487-492)，其在细胞分化、发育调控、基因修饰等研究方面及再生医学方面具有极其重要的应用价值。传统胚胎干细胞建系方法即是将植入前囊胚内细胞团接种于特定干细胞液中进行培养，从而获得干细胞克隆。目前，继小鼠之后，大鼠naive胚胎干细胞通过调整培养系统已成功建立(Li P，2008，Cell 135(7):1299-1310)。诱导性多潜能干细胞的获得即是将不同的重编程因子转入成体已分化的细胞内，将成体已分化细胞重编程为具有多能性的干细胞(Takahashi K，2006，cell126(4):663-76)。

有研究显示通过慢病毒载体将重编程因子转染入猪体外受精囊胚内细胞团，然后接种于2i(CHIR99021和KP)的LIF培养体系，可以获得猪类naive胚胎干细胞(Telugu BP，2011，The Journal of biological chemistry286(33):28948-28953)，但因其未进行嵌合体实验，尚不能认定其为真正的naive胚胎干细胞。同时，该研究由于采取转染内胚团的方式，造成不同的卵裂球暴露于外源病毒和基因的不均一性，从而导致内胚团不同细胞之间基因整合的嵌合性，最终影响胚胎干细胞的培养和建系效率。

目前，在使用传统方法建立naive胚胎干细胞系的方面，小鼠和大鼠已成功建立，但猪naive胚胎干细胞目前仍未能建立稳定的细胞系。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法。

本发明提供的一种naive胚胎干细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)建立同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的转基因阳性动物胎儿成纤维细胞系；

(2)得到转基因阳性的囊胚；

(3)将囊胚内细胞团接种于细胞饲养层；

(4)诱导外源转录因子表达，获得动物胚胎干细胞系，待能够稳定传代后，停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC，获得naive胚胎干细胞。

所述动物为有蹄类动物。

优选地，所述有蹄类动物为猪、牛、羊。

步骤(3)所述囊胚为发育5-6天的囊胚。本申请实施例选用发育5.5天的猪囊胚。

步骤(3)所述的细胞饲养层为含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液的丝裂霉素预处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层。

预处理小鼠胎儿成纤维细胞的方法为：38.5℃，5％CO₂培养鼠胎儿成纤维细胞至汇合度95％时，向含10％血清(FBS)的DMEM培养液中添加丝裂霉素C处理。