[发明专利]活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及活性提高的α‑淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用。突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的经过改良的α‑淀粉酶菌株在180小时的发酵酶活达到36900U/mL，比改造前的α‑淀粉酶生产菌提高41.5％。因此，本发明的突变α‑淀粉酶BsaAmy6及重组工程菌，大大降低了发酵生产成本，为其进一步工业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体及其编码基因和应用。

背景技术

α-淀粉酶，系统名称为1,4-α-D-葡聚糖水解酶，别名为液化型淀粉酶、液化酶、α-1，4-糊精酶。α-淀粉酶是一种内切水解酶，其主要作用是催化淀粉的1,4-α-D-葡聚糖生成还原性糊精和糖类，在淀粉、清洁剂、饮料和纺织等领域具有重要作用。

由于从自然界筛选得到的野生菌产的α-淀粉酶的活力一般都比较低，不能直接运用于工业化的发酵生产。现有技术一般是通过对野生菌株进行诱变、杂交育种等技术手段来提高菌株的产酶能力。随着分子生物学的迅速发展，基因工程育种技术越来越受到国内外研究者的青睐。

好盐芽孢杆菌Bacillus salsusα-淀粉酶AmyL是一种中温淀粉酶，本课题组通过一系列应用评价实验发现AmyL在许多工业领域具有应用潜力。在造纸工业中，α-淀粉酶AmyL可以很好的改良纸张涂层淀粉的黏度和浓度，提高纸张的质量。饲料工业中，α-淀粉酶AmyL可以帮助幼龄动物消化利用淀粉，对其生长性能与饲料转化率十分有益。虽然α-淀粉酶AmyL具有很大的应用潜力，但目前α-淀粉酶AmyL的生产活力低，发酵成本高。为了使好盐芽孢杆菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL广泛应用到众多工业领域中，提高其比活力及表达水平，降低生产成本是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是通过对来源于好盐芽孢杆菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL进行分子改造，改造后的α-淀粉酶具有更高的比活，降低生产成本，符合工业化大生产的要求。

本发明的目的是提供活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体。

本发明的再一目的是提供编码上述α-淀粉酶AmyL突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述的活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述的活性提高的α-淀粉酶AmyL突变体基因的重组菌株。

好盐芽孢杆菌Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明采用易错PCR及定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶AmyL进行分子改造，经过高通量筛选得到高比活α-淀粉酶BsaAmy6，本发明的高比活α-淀粉酶BsaAmy6和原有的Bacillus salsus的α-淀粉酶AmyL相比，有7个氨基酸的差异，突变位点由+18N,+39S,+159Y,+220T,+281N,+363S,+474Y突变成+18D,+39N,+159D,+220K,+281D,+363C,+474K。突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本发明还提供了上述突变α-淀粉酶BsaAmy6的基因序列，其碱基序列如SEQ IDNO.3所示：

本发明还提供了包含上述活性提高α-淀粉酶的重组载体，将本发明的活性提高α-淀粉酶基因BsaAmy6连接到酵母表达载体pPICzαA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-BsaAmy6。