[发明专利]一种基于实时定量PCR的贝类性别鉴定的方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，尤其是一种基于实时定量PCR的贝类性别鉴定的方法。鉴定方法如下：受检个体性腺取材；总RNA提取；反转录合成cDNA；实时定量PCR检测FOXL2和DMRT的表达量；用方法处理数据，计算LOG₁₀(DMRT/FOXL2)，确定性别。本发明无需使用特殊仪器，只需掌握一般实验操作技能，具有简便、准确、灵敏的特点。对通过表型观察和组织切片无法鉴定的雌雄个体具有普适性，在贝类养殖与育种研究中具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术中的贝类性别鉴定技术，具体地说，是一种简便高效地运用实时定量PCR技术实现贝类性别鉴定的方法。

背景技术

贝类养殖是我国海水养殖的主导产业之一，其产量占海水养殖总产量的70％以上。性别鉴定是贝类养殖和育种工作中不可缺少的环节。但除少数贝类第二性征比较明显外，绝大多数难以根据外部性征判定其性别。目前，对其性别鉴定的方法主要有两种，表型观察法和组织切片法。表型观察法虽然简单，但只适用于一些在生长期或成熟期雌雄性腺颜色有明显区别的物种；组织切片法适用于对增殖期、生长期和成熟期性腺的性别鉴定，对于休止期性腺则较困难，且该方法操作繁琐。

迄今为止，在贝类中未见有关于性染色体的报道，尚难以从DNA水平实现性别鉴定。但已有对虾夷扇贝，太平洋牡蛎等的性腺转录组分析显示，成熟的卵巢和精巢存在大量的差异表达基因，其中包括一些已知的脊椎动物性别决定基因，这些基因可能在贝类性别的维持中起着重要作用，有望用于贝类性别鉴定。FOXL2为叉头框转录因子家族成员，是脊椎动物卵巢发育、分化及功能维持的关键基因。DMRT则是很多无脊椎动物和脊椎动物所共有的性别分化的关键基因，对精巢的形成和维持起着重要作用。虽然贝类的性别决定的分子机制至今尚不清晰，我们发现，根据FOXL2和DMRT在卵巢和精巢中差异表达这一特征，可对贝类各发育时期的性腺进行性别鉴定。

实时荧光定量PCR是对特定核酸序列进行准确定量的方法，被认为是基因表达定量的“金标准”。其原理是对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板的定量分析。它不仅操作简便、快速高效，还具有极高的灵敏性、重复性和特异性。该技术已被广泛应用于分子生物学研究的各个领域。

本发明旨在选取合适的贝类雌雄性别表征基因组合，建立一种准确的定量与计算方法，稳定地对处于各发育时期(包括休止期)的性腺进行性别鉴定。

发明内容

本发明的目的是克服现有表型观察法和组织切片法存在的缺陷，提供一种基于实时定量PCR的贝类性别鉴定的方法，简便高效地实现贝类的性别鉴定。

本发明提供一种鉴定贝类性别的方法，即通过实时定量PCR检测贝类性腺组织中雌性表征基因FOXL2和雄性表征基因DMRT的表达量，从而确定性别。具体标准为：实时定量PCR检测FOXL2和DMRT表达量，用2^-△Ct方法计算DMRT和FOXL2的相对表达量，根据LOG₁₀转换后的值确定性别；如果获得的数值大于2，则该个体为雄性；如果获得的数值小于0，则该个体为雌性。在上述方案的基础上，需针对不同的贝类设计两对雌雄性别表征基因FOXL2和DMRT的特异性引物进行实时定量PCR检测。

具体步骤如下：

(1)受检个体性腺取材

受检贝类材料低温取回后在循环池中暂养，待新陈代谢稳定再进行解剖，性腺取材需规避其它组织的污染。

(2)总RNA提取

Trizol法提取总RNA，所得RNA用琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并通过分光光度计测定浓度。

(3)反转录合成cDNA

以mRNA为模板，dNTP为底物，Oligo d(T)为引物，用反转录酶合成cDNA。