[发明专利]一种用于荧光原位杂交的动力相关蛋白1基因引物及其cRNA原位杂交探针的制备方法

权利要求书

1.一种用于荧光原位杂交的动力相关蛋白1基因的cRNA原位杂交探针的制备方法，其特征在于，按照如下步骤：

(1)根据drp1基因的Gene bank序列，设计三对drp1的特异引物，并且分别对此特异引物扩增出drp1基因对应的序列，该序列作为drp1蛋白特异的探针序列；

(2)构建drp1的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；

(3)制备drp1的cRNA原位杂交探针；

(4)检测drp1的cRNA探针的原位杂交。

2.基于权利要求1所述cRNA原位杂交探针的制备方法，其特征在于，所述探针序列为：

drp1基因片段1的序列为：

5'GCTCAGTGCTGGAAAGCCTAGTGGGCAGGGACCTTCTTCCCAGAGGAACTGGTGTGGTCACCCGGAGACCTCTCATTCTGCAGCTAGTCCACGTTTCACCAGAAGATAAAAGAAAAACAACAGGAGAAGAAAATGAAATTTCAGAGCTGGAGAGTTGAAGCAGAAGAATGGGGTAAATTTCTTCACACCAAAAACAAGCTTTACACAGATTTTATGAAATTCGACAAGAAATTGAAAATGAAACTGAAAGAATTTCAGGAAATAATAAGGGGGTAAGCCCTGAGCCAATCCATC3′

drp1基因片段2的序列为：

5'TTCGTAAAAGGTTGCCCGTGACAAATGAAATGGTGCATAACTTAGTGGCAATTGAGCTAGCGTATATCAACACAAAACACCCCGACTTTGCTGATGCCTGTGGGCTAATGAACAATAATATAGAGGAACAAAGAAGAAACAGGCTAGCAAGAGAGCTGCCTTCAGCTGGATCACGGGACAAGTTAATTCAGGACAACAGAAGAGAAACTAAAAATGTCCCATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACA3′

drp1基因片段3的序列为：

5'CATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACAGGCAACTGGAGAGGAATGCTGAAAACTTCAAAAGCTGAAGAATTACTTGCTGAAGAAAAATCAAAACCAATTCCAATTATGCCAGCAAGTCCACAGAAAGGCCATGCTGTCAATTTGCTAGATGTGCCAGTTCCAGTTGCAA3′。

3.基于权利要求1所述cRNA原位杂交探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下步骤进行：

(a)将小鼠的cDNA用drp1基因的3对特异的引物分别进行PCR扩增；

(b)将PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒进行胶回收；

(c)将回收后的产物使用TA克隆载体试剂盒于室温与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接；

(d)将连接好的质粒转化大肠杆菌DH5α，培养；

(e)使用天跟质粒提取试剂盒提取探针质粒后进行测序。

4.基于权利要求1所述cRNA原位杂交探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)按照如下步骤进行：

(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后，经判断确认drp1探针序列插入载体的顺序是正向的；

(b)以测序正确的drp1探针质粒为模板，使用T7，SP6特异引物进行PCR扩增；

(c)将PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒进行胶回收；

(d)用T7-RNA聚合酶/SP6-RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。

5.基于权利要求1所述cRNA原位杂交探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)按照如下步骤进行：

(a)取材并固定包埋组织及切片；

所述取材及固定的方式：将小鼠用7％水合氯醛深麻后，经左心室用0.01mol/L的DEPC-PBS快速冲洗去除血液，再以4％DEPC-多聚甲醛灌注固定24h；将组织转移并浸没于30％蔗糖溶液中脱水至沉底48h；

所述的0.01mol/L DEPC-PBS是2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.29g NaH₂PO₄·12H₂O，9.0g NaCl用ddH₂O定容至1L后，再加入体积百分比为0.1％的DEPC 1ml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；

所述4％的多聚甲醛是40g多聚甲醛加入500ml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml，PB的终浓度为0.1mol/L；

所述0.2mol/LPB缓冲液为29.01g Na₂HPO₄·12H₂O，2.965NaH₂PO₄·12H₂O加ddH₂O定容至1000ml，再加入体积百分比为0.1％的DEPC 1ml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；

所述包埋组织方法：取出固定的组织用包埋剂OTC包埋；将包埋好的组织进行切片：将组织切成25～30μm组织切片，并将切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中，放于4℃冰箱备用；

(b)选取上述组织切片与室温条件下经含有2％H₂O₂的0.1mol/L DEPC-PB处理10min以阻断内源性过氧化物酶；

(c)用0.3％TritonX-100的0.1mol/L DEPC-PB处理20min；

(d)用乙酰化液处理组织切片10min；

(e)用0.1mol/L DEPC-PB清洗组织切片2次，每次10min；

(f)接着将组织放入预杂交液中，58-60℃预杂交1h以封闭非特异结合为点；

所述预杂交液1ml是由500ul的去离子甲酰胺，250ul的20x SSC溶液，200μl的10％阻断剂，50ul的2％的NLS溶液，10ul的10％的SDS溶液配制而成。

所述10％阻断剂是由4g的阻断剂溶于0.1M的马来酸缓冲液中配制而成；

所述0.1M马来酸缓冲液为464mg马来酸，351mg的NaCl溶于ddH₂O中，使用NaOH调节PH至7.5，定容至40ml，高压灭菌。

(g)在预杂交液中加入drp1探针终浓度为1ng/ul，于58-60℃杂交炉中恒温孵育16-20h；

(h)杂交后用wash buffer洗涤杂交的组织切片，58℃，2次，每次20min；

所述wash buffer 10ml是由5ml的去离子甲酰胺，1ml的20x SSC溶液，500ul2％的NLS溶于ddH2O中配制而成；

(i)用RNase buffer洗涤上述的组织切片，室温孵育5min；

所述RNase buffer10ml为1M TRis-HCl,PH8.0，0.5M EDTA，5M NaCl溶于ddH2O中配制而成；

(j)加入终浓度为20ug/ml的RNase A处理，37℃恒温孵育30min，以消化未结合的cRNA探针；

(k)用2x SSC，2％NLS洗涤上述的组织切片，37℃恒温孵育2次，每次20min；

(l)用0.2x SSC，2％NLS洗涤上述的组织切片，37℃恒温孵育2次，每次20min；

(m)将组织切片放在TS7.5溶液中室温孵育5min；所述TS7.5由1MTRis-HCl，PH8.0，5M NaCl溶于ddH₂O中配制而成；

(n)将组织切片于TBS中室温封闭1h；所述TBS为含有1％阻断剂的TS7.5溶液；

(o)在组织切片加入地高辛抗体，效价为1:100-1:1500，室温孵育过夜；

(p)将上述切片TNT中室温洗涤2次，每次10min；

(q)将切片用0.1mol/L PB室温洗涤10min；

(r)加入β-D-Glucose(200mg/ml)1:100稀释，室温孵育30min；

(s)将切片用0.1mol/L PB室温洗涤10min；TNT中室温洗涤2次，每次10min；

(t)加入含有FITC-avidin(1:500)的TBS溶液避光室温孵育3h；

(u)将上述切片TNT中室温洗涤3次，每次10min；

(v)使用荧光封片剂将上述组织切片封片，荧光显微镜下观察。