[发明专利]一种用于荧光原位杂交的动力相关蛋白1基因引物及其cRNA原位杂交探针的制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物医学领域，涉及一个基因的三种探针及其设计方法，尤其是一种动力相关蛋白1基因cRNA原位杂交的探针及其制备方法。

背景技术：

神经元作为神经系统的基本结构和功能单元，具有高度极化细胞，轴突和树突，常需要大量能量以维持正常神经回路。而线粒体作为细胞持续供能的场所，在神经元的发育及功能中发挥重要作用。其中线粒体的数量、质量及分布三者直接决定神经元的功能。

线粒体表现在形态上的动力学改变，处于不断的融合与分裂过程中。线粒体的融合与分裂的动态平衡过程对正常细胞内稳态及生理机能的维持至关重要。其中动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,drp1)是调控线粒体分裂的关键蛋白。在线粒体分裂过程中drp1转移至线粒体外膜上，进行组装和寡聚化，通过GTP水解作用使线粒体外膜分裂为两部分。而分裂蛋白主要是通过对drp1的绑定和募集促进分裂的。研究发现，Drp1的活性还与多种神经退行性疾病是紧密相连。因此，对drp1的研究将有助于我们深入理解线粒体在神经系统中的重要功能意义，为疾病的发病机制研究提供新的思路，以期寻找到新的治疗靶点。

荧光原位杂交技术是根据已知特异的DNA序列，设计合成特异寡聚核苷酸探针，利用荧光标记与生物体中互补的核苷酸杂交，通过荧光进行精确定量定位，检测生物体中核苷酸的存在与表达丰度。而关于利用荧光原位杂交技术检测drp1基因在活体动物中mRNA丰度显示尚属空白。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种动力相关蛋白1基因用于荧光原位杂交的引物及探针的设计和制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

一种动力相关蛋白1基因cRNA原位杂交的探针，同一个基因，分别从中间 找出三种不同大小的片段设计并合成引物。

drp1基因片段1的序列为：

5'GCTCAGTGCTGGAAAGCCTAGTGGGCAGGGACCTTCTTCCCAGAGGAACTGGTGTGGTCACCCGGAGACCTCTCATTCTGCAGCTAGTCCACGTTTCACCAGAAGATAAAAGAAAAACAACAGGAGAAGAAAATGAAATTTCAGAGCTGGAGAGTTGAAGCAGAAGAATGGGGTAAATTTCTTCACACCAAAAACAAGCTTTACACAGATTTTATGAAATTCGACAAGAAATTGAAAATGAAACTGAAAGAATTTCAGGAAATAATAAGGGGGTAAGCCCTGAGCCAATCCATC3′

drp1基因片段2的序列为：

5'TTCGTAAAAGGTTGCCCGTGACAAATGAAATGGTGCATAACTTAGTGGCAATTGAGCTAGCGTATATCAACACAAAACACCCCGACTTTGCTGATGCCTGTGGGCTAATGAACAATAATATAGAGGAACAAAGAAGAAACAGGCTAGCAAGAGAGCTGCCTTCAGCTGGATCACGGGACAAGTTAATTCAGGACAACAGAAGAGAAACTAAAAATGTCCCATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACA3′

drp1基因片段3的序列为：

5'CATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACAGGCAACTGGAGAGGAATGCTGAAAACTTCAAAAGCTGAAGAATTACTTGCTGAAGAAAAATCAAAACCAATTCCAATTATGCCAGCAAGTCCACAGAAAGGCCATGCTGTCAATTTGCTAGATGTGCCAGTTCCAGTTGCAA 3′

所述探针的制备方法：

(1)根据drp1基因的Gene bank序列我们设计了3对drp1特异的引物；

(2)构建drp1基因的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；

(3)制备drp1基因的cRNA原位杂交探针；

(4)检测drp1基因的cRNA探针的原位杂交。

所述步骤(1)drp1基因3对引物如下：

所述步骤(2)按照如下步骤进行：

(a)将小鼠的cDNA用drp1基因的3对特异的引物分别进行PCR扩增；

(b)将PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒进行胶回收；