[发明专利]一种稻曲病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种稻曲病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法。

背景技术

稻曲病是水稻的重要病害，发病严重时可给稻粮生产造成重大经济损失。防病控害的有关研究，通常都要使用稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)材料。稻曲病菌在普通培养基上可缓慢生长成为菌丝体发达的菌落；在实验室工作中，通常用试管斜面培养基将稻曲病菌培养成斜面菌落，并以菌落的菌丝体作为日常工作材料的常备形态。有关研究工作的出发点均以常备形态菌丝体材料为起始，通过移植常备形态菌丝体，进行扩大培养或进入具体项目的研究工作。这种以菌丝体作为日常工作材料的常备形态，通常较简单方便，不过也存在某些不足，如下：

在与生长速率(或生长量)测定有关的研究工作(如生长发育的影响因素测定，药物的抑制作用测定等)中，往往需要菌丝体的定量移植，而移植培养基中的菌丝体却很难做到准确定量，至今的常规方法是需要先移植菌丝体到培养平板上扩大培养，然后用打孔器在扩大培养的平板菌落上打取等同直径的菌丝块，以此菌丝块进行定量移植；这种定量方式不仅要增加一段扩大培养的程序环节，而且由于培养平板的厚薄不一致，以及菌落不同部位菌丝体的密集程度、生理状态等也有差异，造成不同菌丝块之间难以达到较高的一致性。

许多研究工作(如孢子萌发的影响因素，病害接种等)，使用的直接材料通常是薄壁分生孢子，同样要将常备形态菌丝体移植到合适的培养基，先行孢子制备培养工作，获得孢子后才能实施相关工作。这相当于相关工作进程需要延后，不能及时开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种稻曲病菌实验室材料的常备形态及其制备与应用方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种稻曲病菌实验室材料的常备形态，是用稻曲病菌的薄壁分生孢子作日常工作的常备形态；薄壁分生孢子纯净无污染；薄壁分生孢子存放于无菌水中；薄壁分生孢子暂停生长发育，但转到培养基上能马上恢复正常生长发育。

一种稻曲病菌实验室材料的常备形态的制备与应用方法，制备与应用方法步骤如下：

1.分生孢子的预培养

以当前实验室稻曲病菌的常备菌丝体为初始菌体，采用常规的液体振荡培养方法，培养获得含有薄壁分生孢子的培养产物。

2.分生孢子的培养制备

用三角瓶作培养器具，装盛马铃薯琼脂培养基作产孢培养基，该培养基的组分配比为：马铃薯100g、琼脂20g、水1000mL；用移液器从步骤1获得的含有分生孢子的培养产物中，吸取少量液体，移植入三角瓶内的产孢培养基面上并涂布均匀，在合适的温度下培养，直到培养基面上形成密布的微小菌落，菌落上形成大量的新一代薄壁分生孢子。

3.稻曲病菌材料常备形态的制备

取无菌水注入步骤2培养获得的产孢菌落上，轻轻洗脱菌落上的孢子，获得含有菌丝碎段的孢子液；用灭菌纱布过滤去除该孢子液中的菌丝碎段；将该孢子液进行离心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混杂的菌体代谢产物和培养基组分；剩下的沉淀为纯净的薄壁分生孢子，以该纯净孢子作为稻曲病菌材料的常备形态；用无菌水将沉淀孢子悬浮，搅动使孢子充分分散，获得稻曲病菌材料的常备孢子液。

4稻曲病菌材料常备形态的孢子含量标定

用无菌水将步骤3获得的常备孢子液的孢子浓度，调配为10⁶孢子/mL。

5稻曲病菌材料常备形态的日常存放

在无菌条件下，将步骤4标定的常备孢子液分装到有盖密闭的灭菌容器内，并转移到25℃的暗环境中存放备用。

6稻曲病菌材料常备形态的应用

将步骤5存放的稻曲病菌材料常备孢子液转到超净工作台，振荡装存常备孢子液的容器，使薄壁分生孢子充分悬浮和分散；开盖后用移液器定量吸取孢子液，移植到相关的工作环节或实验程序中；吸液移植操作完毕后回盖密封，将剩余的常备孢子液转回步骤5的存放处存放。

本发明的特色与优点是：

1)常备形态的薄壁分生孢子在纯水中暂停生长但能长期保持活力，一旦转到培养基，能马上恢复正常生长。

2)可在相关工作中随时应用，能为需要薄壁分生孢子的试验环节直接提供菌体材料，可省去使用菌丝体作为常备材料时，需要反复制备培养孢子的工作程序，工作方便快捷。

3)用三角瓶作培养器具，容易获得无污染的纯净孢子液，制备获得的常备形态质量较高。

4)能标定常备孢子液的孢子含量，应用时可以准确定量取用，利于技术方法标准化。

附图说明