[发明专利]源于牡蛎的ACE抑制肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物来源活性物质的制备，尤其涉及生物来源的活性物质的提取分离方法。

背景技术

肽的消化吸收理论的进展证实了机体可直接吸收小分子肽类物质，肽类物质不但可以作为营养的有益补充，有些具有一定序列的肽还具有特殊的生理活性――即生物活性肽。来源于食物蛋白质中的小分子生物活性肽具有如下优势：分子质量小，易于消化吸收，不易引起免疫原性；空间构效关系简单，易于进行活性机理的研究；来源于食物蛋白质，不易引起毒副作用。

目前以食物蛋白质为原料，制备小分子肽的方法主要有：蛋白质的酸碱水解法、蛋白质的微生物发酵法、蛋白质的酶降解法。蛋白质的酸碱水解法方法简单，速度快，生产成本低廉，然而，其蛋白质水解度难于掌控，某些氨基酸易于被破坏，同时生产过程容易造成环境污染。蛋白质的微生物发酵法成本低廉，然而其生产时间过长，分离过程复杂，由于需要维持微生物生长，因此其蛋白质利用度大大下降。蛋白质的酶降解法，其水解程度易于掌控，酶解时间短，蛋白质利用度高，酶解产物易于分离，成本低廉；但纯肽产量较低，使得大规模的工业化生产受到一定的限制。而通过微生物发酵结合蛋白酶解的方法，可以在一定程度改善酶解产物的性状、产量，利于规模化生产。

近20年来，已有不少研究学者对牡蛎蛋白进行酶解，获取牡蛎寡肽，如抗HIV-1寡肽、抗氧化寡肽和ACE抑制寡肽。ACE是一种Zn-依赖型、胞外分泌的二肽羧肽酶，其可将Ang I转化为Ang II，Ang II与G-蛋白偶联受体ATR结合作用到靶细胞上，引起一系列升血压的过程。同时，ACE还能使一系列具有降血压作用的血管舒缓肽失活，引起机体血压的进一步升高。因此，ACE活性的抑制可有效的缓解高血压及其相关疾病。本发明人前期工作中，从牡蛎可溶性蛋白中分离得到ACE抑制肽(氨基酸序列为：VVYPWTORF)，IC₅₀值为0.079mg/mL(66μmol/L)，经检测具有优异的ACE抑制活性，但从牡蛎中提取产率很低，严重影响了其应用设计及后续工作的开展。一直以来，我们致力于获得更多的天然来源的该短肽产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高牡蛎来源ACE抑制肽(氨基酸序列为：VVYPWTORF)产量的方法，本发明的源于牡蛎的ACE抑制肽的制备方法，包括用胃蛋白酶对牡蛎蛋白进行酶解的步骤，其中所述的酶解时，体系中添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌按照任意比例组成的复合菌剂。同等生产条件下，使用本法吗的方法能够有效大幅提高牡蛎来源的ACE抑制肽的产量，方法简单易行，易于推广并实现产业化应用。

附图说明

本发明附图1幅，即LH-20凝胶色谱对牡蛎酶解产物的分离结果图谱。

具体实施方式

本发明涉及一种源于牡蛎的ACE抑制肽，即氨基酸序列为VVYPWTORF活性短肽的制备方法。从牡蛎中制备具有ACE抑制活性的短肽，需要对牡蛎蛋白进行酶解。本发明也包括使用胃蛋白酶对牡蛎蛋白进行酶解的步骤，特征性地，本发明在酶解体系中添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌按照任意比例组成的复合菌剂。

具体实施方式中，在复合菌剂的添加量方面，考察的结果显示，优选的复合菌剂的用量为牡蛎蛋白质量的0.4～0.6％。更优选0.5％。在复合菌剂的组成来看，由枯草芽孢杆菌和乳酸菌按照质量比1:1组成的复合菌剂对本发明的效果是最佳的。

另一具体实施方式中，对添加了复合菌剂的酶解过程参数进行考察，发现：单纯的酶解过程对过程参数的设计要求并不高，即各种可实施参数条件下的酶解结果无显著性差异。而添加了复合菌剂的酶解过程，便不单单是酶解过程，其中还包括了微生物发酵及作用的过程，对参数的变化更为敏感。考察结果发现，采用下述酶解过程/参数，能获得优选的结果：37±2℃条件下搅拌反应8～10h，之后体系于4±2℃静置8～10h，然后再于37℃搅拌反应6～8h。其中所述的搅拌过程可采用常规方法，例如但不限于低速磁力搅拌。

较为具体地，本发明所述的活性短肽的制备方法包括如下步骤：

(1)以新鲜牡蛎为原料制备牡蛎蛋白；

(2)将步骤(1)所制备的牡蛎蛋白按照2g/100ml的浓度加入至0.05mol/L的磷酸缓冲液中，并加入胃蛋白酶及复合菌剂，混合均匀后于37±2℃条件下搅拌反应8～10h，之后体系于4±2℃静置8～10h，然后再于37℃搅拌反应6～8h；

所述的胃蛋白酶的添加量为牡蛎蛋白质量的1.5％；

所述的复合菌剂的添加量为牡蛎蛋白质量的0.5％；