[发明专利]一种提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法。

背景技术

酪酸菌(丁酸梭菌，Clostridium butyrium)作为人用或动物新型益生菌具有调整肠道菌群平衡、增强免疫、预防肿瘤发生等重要功能。酪酸菌的营养需求对其生长影响显著，常用的补料方法是补入氮源如蛋白胨、酵母膏、豆粕、豆粉水解液、鱼粉等和碳源如葡萄糖等，如：对比文献1(采用分批补料发酵法制备酪酸菌活菌制剂的方法，发明专利CN201110287802.1，2011)公开了酪酸菌发酵12-14h流加10-20％的葡糖糖溶液至发酵结束前8h以及发酵13-15h流加5-10％的豆粉水解液至发酵结束前10h的补料方法；对比文献2(一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，发明专利CN201210135950.6，2012)公开了一种连续发酵生产酪酸菌的方法，其中补入的氮源是6-8％的豆粉水解液，碳源是4-5％的葡萄糖。

出于酪酸菌对氮源营养需求的考虑以及有机氮源成分对酪酸菌生长代谢影响的复杂性、不确定性和未知性，对比文献1和2采用了有机氮源(豆粉水解液)和葡萄糖(碳源)来笼统地满足酪酸菌的氮源需求。但是，这些有机氮源成分复杂、用量较大，使得生产成本较高。另外，对比文献1和2的补料方式也不涉及补料速率参数的控制。第三，酪酸菌发酵生长过程中合成大量的丁酸和乙酸是其代谢自适应进化的结果。但是，乙酸、丁酸的积累也会引起酸胁迫效应，并引起细胞自溶。显然，对比文献1和2均没有涉及酪酸菌在发酵过程中的酸代谢的内容。因此，若基于酪酸菌酸代谢的特点进行成分确定的补料则可能使酪酸菌发酵效率进一步提高。选择合适的补料方式与补料成分可能会实现上述目的。

基于微生物细胞对数生长的特点，对比文献3(Wang Y,Wang ZH,Du GC等,2009,Bioresource Technology,Enhancement of alkaline polygalacturonate lyase production in recombinant Pichia pastoris according to the ratio of methanol to cell concentration,100:1343-1349)根据指数补料方程指导补料速率的设定。科学技术工作者利用该方程进行指数补料的应用时，通常认为：设定的比生长速率越接近细胞的最大比生长速率，细胞会越接近以最大比生长速率进行生长繁殖，一般会把比生长速率设定为最大比生长速率的80-90％，代入方程计算出每小时的补料速度，从而维持细胞的对数生长。对比文献3把该技术应用至毕赤酵母的指数补料发酵过程，比生长速率设定为最大比生长速率的80％，也获得了良好效果。现有技术没有把指数补料模式应用于厌氧微生物-酪酸菌发酵补料过程的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高酪酸菌发酵生长效率的补料新方法，其是一种通过优化酪酸菌比生长速率以及控制酸代谢来提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法。

本发明目的通过下述技术方案实现：

一种提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法为：在酪酸菌发酵培养6h时开始进行指数流加葡萄糖溶液至13h，比生长速率设定在0.1-0.4h^-1。优选为：在酪酸菌发酵培养6h时开始指数流加葡萄糖溶液至13h，比生长速率设定为0.225h^-1(最大比生长速率的40％)。所述的葡萄糖溶液的浓度优选为500g/L；葡萄糖溶液的流加速率优选如下：发酵6-7h流加速率为210mL/h，发酵7-8h流加速率为260mL/h，发酵8-9h流加速率为330mL/h，发酵9-10h流加速率为410mL/h，发酵10-11h流加速率为510mL/h，发酵11-12h流加速率为640mL/h，发酵12-13h流加速率为800mL/h。

优选的，所述的提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法，包括如下步骤：

(1)种子扩大培养与合瓶种子细胞的收集

按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌菌种冻干管接出细胞至新制备的厌氧管斜面培养基。36-38℃培养12-16h后，按无菌、无氧操作要求，加入10mL无菌、无氧水制备厌氧管种子液。

120mL厌氧瓶装培养基60mL，按1-2％的比例(v/v)将酪酸菌厌氧管种子液接入厌氧瓶培养基中，36-38℃、100r/min在摇床上培养12-14h得到厌氧瓶种子液。按无菌、无氧操作要求，将厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到合瓶种子液。

(2)发酵培养