[发明专利]生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系建立及其应用

权利要求书

1.一种生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、利用CRISPR/Cas9技术，针对CHO-S细胞FUT8基因的exon9区域设计两对sgRNA；构建FUT8敲除载体pX330-sgRNA1质粒和pX330-sgRNA2质粒；

S2、将pX330-sgRNA1质粒和pX330-sgRNA2质粒利用脂质体转染法共转染进CHO-S细胞，敲除CHO-S细胞中的FUT8基因，得到FUT8基因沉默的稳定FUT8^-/-细胞株。

2.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述FUT8^-/-细胞株的两条等位基因都发生了基因突变。

3.根据权利要求2所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述两条等位基因中一条为基因移码，一条为基因缺失。

4.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述FUT8^-/-细胞株具有兵豆凝集素抗性。

5.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述两对sgRNA中，sgRNA1的碱基序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，sgRNA2的碱基序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，步骤S2中，所述共转染前，用CD-CHO+8mM谷氨酰胺的培养基培养CHO-S细胞，并在转染前12h，将CHO-S细胞用DMEM+10％FBS+MEMNEAA培养基贴壁培养。

7.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，步骤S2还包括LCA加压筛选出FUT8基因敲除细胞的步骤。

8.一种FUT8^-/-细胞株，其特征在于，根据权利要求1所述方法获得FUT8基因沉默的CHO-S细胞株，经无血清悬浮驯化培养获得FUT8^-/-细胞株。

9.一种生产无岩藻糖单克隆抗体的方法，其特征在于，构建可以表达抗体的pcDNA3.1-HC抗体重链质粒及pcDNA3.1-LC抗体轻链质粒，使用PEI共转染如权利要求1所述方法获得的FUT8^-/-细胞，表达产生完全无岩藻糖单克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的方法，其特征在于，共转染抗体重链和轻链，重链轻链表达后组装。