[发明专利]DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用

权利要求书

1.DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、构建表达宿主BL21-AL

构建表达框架，所述表达框架从5’到3’方向依次为tac 启动子、核苷酸序列为Seq IDNo.1的hemA基因、核苷酸序列为Seq ID No.2的hemL基因、核苷酸序列为Seq ID No.11 的thrA基因，插入到pET28a质粒上构建成pET28a-hemAL；

以质粒pkd3为模板，PCR扩增氯霉素抗性基因与两侧的FRT位点，添加E.coli thrA基因5′端同源臂，插入到pET28a-hemAL，构建成pET28a-hemAL-Cm；

将质粒pkd46转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建成大肠杆菌BL21-46，再将pET28a-hemAL-Cm导入到BL21-46，进行red重组后，导入质粒pCP20，敲除氯霉素抗性基因，构建成表达宿主BL21-AL；

b、构建表达载体pCspA-dypB

将核苷酸序列为Seq ID No.3的DypB基因插入到pET28a载体中，构建pET28-dypB，以E.coli为模板，PCR扩增cspA基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如Seq ID No.4所示，插入到pET28-dypB中，构建成表达载体pCspA-dypB；

c、DypB蛋白的表达与纯化

将步骤b中的表达载体pCspA-dypB导入步骤a所述的表达宿主BL21-AL中，IPTG诱导表达，Ni亲和层析法进行纯化，得到高纯度的DypB活性蛋白。

2.根据权利要求1所述的DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于：步骤a中所述表达框架的插入位点为BglⅡ和EcoRⅠ。

3.根据权利要求1所述的DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于：步骤a中所述构建pET28a-hemAL-Cm时，插入位点为SphⅠ和BglⅡ。

4.根据权利要求1所述的DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于：步骤b中所述的PCR扩增的引物为核苷酸序列如Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的引物。

5.根据权利要求1所述的DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于：步骤b中所述的插入位点为NdeⅠ和Hind Ⅲ。

6.根据权利要求1所述的DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于：步骤c中所述的IPTG诱导表达温度为14~25℃，诱导表达时间为10~24h。

7.根据权利要求1所述的DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于：步骤c中所述的Ni亲和层析操作条件为：10~50mM Tris-HCl，200~500mM NaCl，0~10mM imidazole平衡;10~50mM Tris-HCl，200~500mM NaCl，30~100mM imidazole洗脱杂蛋白; 10~50mM Tris-HCl，200~500mM NaCl，300mM~1M imidazole洗脱目的蛋白。