[发明专利]DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用

说明书

本发明属于基于工程技术领域,具体涉及一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。针对现有的DypB蛋白在异源表达时没有活性，需要体外结合血红素才能产生活性的问题，本发明提供一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。本发明先通过基因重组，将表达血红素的相关基因整合到宿主细胞中，使宿主存在高浓度的血红素，再将DypB构建成重组载体后，导入血红素高表达的表达宿主中，从而实现了DypB活性蛋白的异源高表达。本发明通过在表达宿主中整合血红素合成相关基因提高血红素体内积累浓度，然后通过冷诱导方式大量表达DypB，使DypB经宿主表达后具有了降解木质素的活性。

技术领域

本发明属于基于工程技术领域,具体涉及一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。

背景技术

木质素是一种广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物。木质素属天然芳香族高分子聚合物,由苯基丙烷单元通过醚键(C-OC)和碳-碳键(C-C)连接聚合而成的复杂的、无定形的三维空间结构,依苯丙烷的侧链取代基不同,木质素又可以分为松柏醇(Coniferyl alcohol)、香豆素(p-Coumarylalcoho1)和芥子醇(Sinapyl alcoho1)等结构单元。这些结构单元存在多样性，重复单元间缺乏规律性和有序。

自然界中，木质素几乎全部与纤维素伴生，木质素与半纤维素以共价键形式结合,将纤维素分子包埋在其中,一方面极大提高了纤维素在纤维垂直方向上的刚性，另一方面形成一种天然阻碍，使纤维素酶类不易与纤维素分子大面积作用，维持纤维素分子的稳定性。这也造成在纤维素酶解过程中由于酶作用方式受到木质素-纤维素紧密结构的影响不能同时多点消化底物，造成实际酶解效果相对迟滞，给纤维素水解造成内因性困难。

由于木质素结构的复杂性,相应降解木质素的酶系也很复杂,牵涉到胞外大分子氧化降解和胞内小分子分解代谢反应。木质素的生物降解代谢是通过微生物产生的木质素酶的作用实现的，研究结果表明，在自然界中木质素的降解是真菌、放线菌和细菌三者共同作用的结果。

国内外关于木质素酶的研究主要是基于白腐真菌-黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，它可分泌出一套可降解木质素的多酶系统，主要以以下三种酶为主：

木质素过氧化物酶(LiP)，代表一系列含有Fe³⁺、卟啉环的同工酶。LiP的催化底物具有非特异性，包括酚类和非酚类芳香化合物，可以氧化木质素单体，二体，三体以及多环芳烃等底物，方式是在H₂O₂的驱动下，通过电子传递体进攻木质素，从苯环上夺取电子，将其氧化成自由基，以此形成链式反应产生更多的不用自由基，最终导致木质素的骨架键断裂，是迄今为止发现的唯一一种可以单独氧化降解非酚型木质素结构的过氧化物酶。

锰过氧化物酶(MnP)同样含有血红素，且还含有Mn²⁺。MnP只能氧化酚型木质素，MnP血红素中的Fe³⁺与H₂O₂结合形成铁过氧化物联合体，形成复合物I，Mn²⁺作为电子供体将复合物I还原为复合物II，同时自身被氧化为Mn³⁺，随后复合物II再被1个螯合的Mn²⁺还原为初始MnP，放出2分子H₂O。Mn³⁺通过整合作用与有机酸(如草酸、丙二酸、苹果酸等)结合形成稳定的高氧化还原电势。螯合的Mn³⁺作为低分子量可扩散的物质，成为氧化还原中介体，是可渗透或扩散到木质素结构中的氧化剂，可以氧化苯酚、甲氧基芳香族化合物、硝基/氯代芳香族化合物，催化断裂芳香族的烷基-芳基键和苯酚的C_α。