[发明专利]原多甲藻的培养基与培养方法

说明书

本发明公开了一种原多甲藻培养基和培养方法，培养基包括下列重量的组分：NH₄NO₃，20‑100mg；CO(NH₂)₂(尿素)，20‑60mg；KH₂PO₄，1‑10mg；NaHCO₃，100‑800mg；MnCl₂·4H₂O 15‑50g；FeC₆H₅O₇·5H₂O(柠檬酸铁)，10‑30mg；VB12，1×10^‑5‑1×10^‑3mg；VB1，50‑200mg；KCl，0.5‑5mg；Na₂EDTA 10‑15g；壳寡糖0.2‑5g（分子量1500‑2000Da）海水1000mL。原多甲藻培养基的培养方法，包括如下步骤：第一阶段：三角烧瓶培养；第二阶段：矿泉水桶培养。本发明给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方，可提高原多甲藻毒素产量并降低养殖成本。且采用矿泉水桶培养原多甲藻与传统的露天开放水泥池式扩大培养相比，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，使原多甲藻生长速度大幅度提高，培养周期缩短。

技术领域

本发明涉及一种原多甲藻培养基配方及采用矿泉水桶充当容器的养殖方法。属于海洋微藻养殖领域。

背景技术

贝类毒素因其强毒性和不可预见性等特点，对消费者健康安全和近海生态安全存在严重威胁，是近年来国际社会较为关注的生态灾害和重大海洋环境问题。氮杂螺环酸毒素（Azaspiracid，AZA）是现有的八大类贝类毒素中发现最晚但毒性最强的一类新型脂溶性贝类毒素，因其毒性强、残留高且代谢慢，成为欧盟、美国、加拿大等国家重点关注的对象，不仅将其限量标准设定为160 µg AZA-1 eq/kg（AZA1-3），数值普遍低于其他贝类毒素，且在国际贸易中重点加以监控。

因此，原多甲藻酸贝类毒素的检测工作，已成为出口贸易和保障消费者安全必要保证。目前国际上标准物质制备方法多是将阳性贝类样品经过萃取纯化后制备而成的，存在的主要问题是样品来源不稳定，批次间存在较大差异；且所需阳性贝类样品量大，运输及提取加工前处理复杂。而以产毒藻为来源的毒素标准品制备，不仅能保障这一毒素的稳定来源，而且由于基质干扰少，是目前最好的标准品制备原料。本申请人于2016年4月8日申请保藏一种氮杂螺环酸毒素的产毒原多甲藻，保藏于中国典型微生物保藏中心，分类命名为：Azadinium poporum AZDY06，生物保藏号为CCTCC NO：M 2016181。具有优良的产毒性状，已初步开发出毒素的提取纯化过程。而目前产毒藻的连续扩大培养、营养液循环与补充以及高浓度产毒藻的收集，成为这一技术的主要制约瓶颈。

目前，采用传统f/2培养基进行原多甲藻培养，藻细胞生长缓慢、细胞密度低、单细胞产毒能力弱（40fg/cell AZA2）、扩大培养时易污染且离心收集耗时。因此，急需开发产毒原多甲藻的扩大培养与毒素制备原料高效收集方法。传统藻细胞扩大培养的方法是露天开放水泥池式培养，藻细胞极易受到污染。本发明给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方，采用矿泉水桶通CO₂方法培养原多甲藻，最大藻细胞密度可达6.5×10⁶cells/ml，最高产毒达（320fg/cell AZA2），整体毒素产量提高了6倍，通过沉降絮凝方式收集的产毒藻，大大降低工作量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种原多甲藻的培养基和培养方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供的原多甲藻培养基，包括下列重量的组分：