[发明专利]一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法

权利要求书

1.一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、热应激奶牛与非热应激奶牛乳腺组织样本采集；

步骤二、Solexa高通量测序鉴定参与奶牛热应激反应的miRNA，寻找差异表达miRNA；

步骤三、差异表达显著的miRNA靶基因预测；

步骤四、差异表达显著的miRNA调控网络构建。

2.根据权利要求1所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，其特征在于，步骤一包括以下内容：

根据系谱资料、奶牛生产性能测定体系DHI数据和牛场记录数据，选取性别相同，饲养环境、年龄及胎次相近的4头热应激奶牛和4头非热应激奶牛作为实验牛，采集乳腺组织样本放入液氮中，到实验室转入-70℃冰箱保存备用。

3.根据权利要求1所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，其特征在于，步骤二包括如下步骤：

(a)用Trizol试剂提取热应激期和非热应激期奶牛乳腺组织总RNA并鉴定；

(b)采用TA克隆和传统Sanger测序对所提总RNA鉴定是否可用于Solexa测序，建立小RNA文库，并进行测序分析验证；

(c)分离长度18-30nt范围的小RNA，两端分别加上特定接头后体外反转录成cDNA，经RT-PCR扩增后用Solexa测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序；

(d)对所测的原始序列进行处理与统计；

(e)将步骤(d)处理过的序列与已知库中序列进行比对分析并分类注释；

(f)鉴定已知miRNA和预测新miRNA；

(g)寻找差异表达miRNA。

4.根据权利要求3所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，其特征在于，步骤二第(a)条包括以下内容：

①取-70℃冻存组织约100mg在液氮中研磨后加入1ml Trizol试剂混匀；

②样品中加入Trizol试剂后反复吹打几次，使样本充分裂解，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离；

③向以上溶液中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟；

④4℃12000rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μl)转移到一个新的RNase-Free离心管中；

⑤在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；

⑥4℃12000rpm离心10分钟，弃上清；

⑦加入1ml 75％乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀；

⑧4℃12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀；

⑨室温放置2-3分钟，晾干，加入30μL无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解；

⑩由1％琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA提取结果，用生物分析仪分析RNA的完整性和浓度。

5.根据权利要求3所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，其特征在于，步骤二第(d)条包括以下内容：

通过去接头、去污染、统计序列长度分布等过程，获得去杂质的“干净”序列(Clean序列)。

6.根据权利要求3所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，其特征在于，步骤二第(e)条包括以下内容：

将Clean序列通过与NCBI Genbank(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)中rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeat、exon、intron和miRNA等库中序列进行比对分析并分类注释。

7.根据权利要求3所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，其特征在于，步骤二第(f)条包括以下内容：

根据牛、人、猪、犬、大猩猩和老鼠等哺乳动物已经注册的miRNA分子信息，用同源搜索的计算分析方法预测牛新的候选miRNA，通过碱基错配、二级结构、A+U含量、自由能大小等分析候选序列特征，鉴定已知miRNA和预测新miRNA。