[发明专利]一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因调控网络技术领域，特别涉及一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法。

背景技术

随着全球气候变暖，热应激对畜牧业的影响越来越严重。而我国幅员辽阔，每年夏季大片区域受热应激影响，导致畜禽代谢紊乱、生产性能和繁殖性能降低，造成严重的经济损失。热应激反应是动物机体一种自我保护机制，相关基因和蛋白质表达发生改变。研究表明，热应激对奶牛的多数免疫指标有重要影响。多数有关缓解热应激发生的研究措施主要是从营养角度出发。关于体外分子诊断的研究方法却较少。

微小RNA(microRNA，即miRNA)通过与靶mRNA特异性的碱基配对，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而发挥基因转录后调节功能。miRNA分子广泛参与到调控细胞生长、发育、分化及凋亡的各个环节，并与动物生理状态的改变以及疾病的发生、发展密切相关。miRNA在哺乳动物泌乳过程中也起着重要的作用。

miRNAs作为一种转录后水平的调控因子，在哺乳动物基因的转录水平中只有1％～5％被编码，却调控超过60％的基因。miRNAs作为一种转录后调控机制，在细胞生长、凋亡，机体免疫和抗应激反应、生长性能和繁殖性能等多方面发挥重要的调控作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法。

一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、热应激奶牛与非热应激奶牛乳腺组织样本采集；

步骤二、Solexa高通量测序鉴定参与奶牛热应激反应的miRNA，寻找差异表达miRNA；

步骤三、差异表达显著的miRNA靶基因预测；

步骤四、差异表达显著的miRNA调控网络构建。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤一中，热应激奶牛与非热应激奶牛乳腺组织样本采集，根据系谱资料、奶牛生产性能测定体系DHI数据和牛场记录数据，选取性别相同，饲养环境、年龄及胎次相近的4头热应激奶牛和4头非热应激奶牛作为实验牛，采集乳腺组织样本放入液氮中，到实验室转入-70℃冰箱保存备用。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二包括如下步骤：

(a)用Trizol试剂提取热应激期和非热应激期奶牛乳腺组织总RNA并鉴定；

(b)采用TA克隆和传统Sanger测序对所提总RNA鉴定是否可用于Solexa测序，建立小RNA文库，并进行测序分析验证；

(c)分离长度18-30nt范围的小RNA，两端分别加上特定接头后体外反转录成cDNA，经RT-PCR扩增后用Solexa测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序；

(d)对所测的原始序列进行处理与统计；

(e)将步骤(d)处理过的序列与已知库中序列进行比对分析并分类注释；

(f)鉴定已知miRNA和预测新miRNA；

(g)寻找差异表达miRNA。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二第(a)条包括以下内容：

①取-70℃冻存组织约100mg在液氮中研磨后加入1ml Trizol试剂混匀；

②样品中加入Trizol试剂后反复吹打几次，使样本充分裂解，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离；

③向以上溶液中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟；

④4℃12000rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μl)转移到一个新的RNase-Free离心管中；

⑤在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；

⑥4℃12000rpm离心10分钟，弃上清；

⑦加入1ml 75％乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀；

⑧4℃12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀；

⑨室温放置2-3分钟，晾干。加入30μL无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解；

⑩由1％琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA提取结果，用生物分析仪分析RNA的完整性和浓度。